張曉彤，周亞男，朱玉翠，胡成進(jìn)，曹源

1.濰坊醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系，山東 濰坊261053，2.濟(jì)南市第三人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)南250132；3.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)診斷科，山東 濟(jì)南250031

腎癌是常見癌癥之一，其中腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）占70%～80%，是最具代表性的亞型，發(fā)病率逐年上升[1-2]。較其他癌癥而言，腎癌相關(guān)生物標(biāo)志物較少，早期診斷困難，且腎癌患者對常規(guī)化療和放射治療反應(yīng)差，缺乏靶向治療藥物，導(dǎo)致晚期患者（Ⅳ期）的五年生存率較低[3]。因此，尋找診斷及伴隨診斷相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物、探索發(fā)病機(jī)制以及找到新的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作為新的潛在生物學(xué)標(biāo)志物和癌癥治療靶點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。lncRNA是一類長度大于200 個堿基且無蛋白質(zhì)編碼能力的轉(zhuǎn)錄物，參與基因表達(dá)的多級調(diào)節(jié)，其異常表達(dá)和突變與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-7]。此外，lncRNA 能在癌癥中特異表達(dá)，并穩(wěn)定存在于循環(huán)體液中[8-10]，可作為癌癥的新型生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶標(biāo)，具有很強(qiáng)的應(yīng)用前景。SNHG12是小核仁RNA 宿主基因，作為一種新的lncRNA，被證實(shí)在肺腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、人骨肉瘤細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、人子宮內(nèi)膜癌等多種癌癥類型中上調(diào)，在癌細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用[11]。然而，腎透明細(xì)胞癌中SNHG12的表達(dá)水平及其臨床意義尚不清楚。本研究旨在探討SNHG12在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)水平及意義，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行靶基因預(yù)測，為后續(xù)SNHG12在ccRCC中的機(jī)制研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 SNHG12在ccRCC中的表達(dá)及生存分析

利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析ccRCC 中SNHG12的表達(dá)水平，分析其與種族、性別、腫瘤分級之間的關(guān)系，并對SNHG12進(jìn)行生存分析。采用logrank檢驗(yàn)，運(yùn)用Kaplan-Meier（KM plotter，http://www.kmplot.com）繪制生存曲線。

1.2 預(yù)測與SNHG12相互作用的microRNA

通過RegRNA2.0（http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/index.html）預(yù)測SNHG12序列上可能存在的mi?croRNA 結(jié)合位點(diǎn)。以最小折疊自由能（minimum folding freeenergy，MFE）≤-20、score 值≥150 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn) 行 預(yù)測，score值為lncRNA 與microRNA 配對得分，得分越高表示兩者的結(jié)合能力越強(qiáng)。同時，通過HMDD v3.0（http://www.cuilab.cn/hmdd）檢索分析與ccRCC 有關(guān)的microRNAs，取此2 種分析結(jié)果的交集預(yù)測在ccRCC 中可能與SNHG12相互作用的microRNAs。用starBase v3.0 數(shù)據(jù)庫（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）探究SNHG12與mi?croRNA 表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.3 預(yù)測microRNA靶基因

用starBase v3.0數(shù)據(jù)庫、Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_61/）及microT-CDS（http://www.microrna.gr/webServer）在線分析平臺預(yù)測mi?croRNA 的靶基因。取3個平臺預(yù)測交集以避免產(chǎn)生過多假陽性結(jié)果，進(jìn)一步分析其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.4 SNHG12-microRNAs-mRNAs相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

分別預(yù)測SNHG12潛在調(diào)控的microRNAs，分析其可能調(diào)控的mRNAs，通過Cytoscope 平臺整合SNHG12、microRNAs 和mRNAs 三者信息，構(gòu)建SN?HG12-microRNAs-mRNAs 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系。

1.5 microRNA靶基因的功能分析

靶基因的生物學(xué)功能分析利用FunRich（http://www.funrich.org/）平臺進(jìn)行，Gene Ontology（GO）中的細(xì)胞組分（cell component）、分子功能（molec?ular function）和生物過程（biological process）條目以及Pathways 中的KEGG 通路條目被用于分析。

2 結(jié)果

2.1 SNHG12在ccRCC中的表達(dá)水平及與患者生存時間的關(guān)系

利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)ccRCC 中的SNHG12表達(dá)量明顯增高（圖1A，P＜0.001），各腫瘤分級均比正常對照表達(dá)增高（圖1B，P值均小于0.001），但分級之間SNHG12的表達(dá)水平無差異（圖1B，P值均大于0.05）。SNHG12表達(dá)量在男女性別之間有差異，男性患者的表達(dá)更高（圖1C，P＜0.001）。此外，不同人種ccRCC 患者間SNHG12的表達(dá)無明顯差異（圖1D，P值均大于0.05）。生存曲線結(jié)果顯示SNHG12高表達(dá)患者的總生存期（overall survival，OS）較低表達(dá)患者明顯縮短（圖2，P=0.0049）。

圖1 SNHG12 在ccRCC 中的表達(dá)水平

2.2 與SNHG12相互作用的microRNAs

RegRNA2.0 生物學(xué)軟件預(yù)測顯示，共有273 個microRNAs 能 夠 與SNHG12結(jié) 合。HMDD v3.0 數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)18 個與腎腫瘤有關(guān)的microRNAs，分別為hsa-mir-106a、hsa-mir-138、hsa-mir-141、hsa-mir-155、hsa-mir-183、hsa-mir-192、hsa-mir-200c、hsa-mir-203、hsa-mir-21、hsa-mir-215、hsamir-23b、hsa-mir-27a、hsa-mir-381、hsa-mir-454、hsa-mir-590、hsa-mir-34a、hsa-mir-362、hsa-mir-497。其 中，hsa-miR-138-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-497-5p與SNHG12結(jié)合的可能性非常大。用starBase v3.0 數(shù)據(jù)庫探究SNHG12與mi?croRNA 表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示SNHG12在ccRCC 中的表達(dá)水平與hsa-miR-138-5p、hsamiR-454-3p、hsa-miR-497-5p均呈正相關(guān)（r值分別為0.124、0.094、0.085，P值均小于0.05）（圖3）。

2.3 microRNAs-mRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通 過targetscan、starBase v3.0 及microT-CDS平臺共同預(yù)測這3 個microRNAs 的靶基因，結(jié)果顯示可能存在288 個靶基因受這3 個microRNAs調(diào)控。其中，hsa-miR-138-5p、hsa-miR-454-3p和hsa-miR-497-5p的靶基因分別有171、52、65 個。hsa-miR-138-5p的靶基因數(shù)量較多，可能參與更為復(fù)雜的調(diào)控通路。

圖2 SNHG12 的表達(dá)與ccRCC 患者的生存關(guān)系

圖3 SNHG12 與3 種microRNAs 的相關(guān)性分析

2.4 SNHG12-microRNAs-mRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

結(jié)合以上SNHG12-microRNAs與microRNAsmRNAs網(wǎng)絡(luò)，最終建立了SNHG12在ccRCC中的SNHG12-microRNAs-mRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括283個節(jié)點(diǎn)和291條邊，283個節(jié)點(diǎn)代表1個SNHG12、3個microRNAs和279個mRNAs，291條邊表示它們之間存在291種相互作用關(guān)系（圖4）。SNHG12位于該網(wǎng)絡(luò)中心，調(diào)節(jié)與之結(jié)合的hsa-miR-138-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-497-5p，進(jìn)而調(diào)控下游279個靶基因。其中hsa-miR-138-5p與hsamiR-454-3p共同調(diào)節(jié)CNOT6L、ZNF275、PLLP、ADCY1、ZEB2，hsa-miR-138-5p與hsa-miR-497-5p共同調(diào)節(jié)CCND3、PAPPA、MINK1，hsa-miR-454-3p與hsa-miR-497-5p共同調(diào)節(jié)ZNF609。

2.5 microRNA靶基因的功能分析

為預(yù)測SNHG12可能參與的生物過程以及信號通路，將參與SNHG12-microRNAs-mRNAs的3個microRNAs靶基因提交到FunRich平臺，進(jìn)行GO及KEGG pathway功能分析。GO分析結(jié)果顯示，microRNA靶基因在堿基、核苷、核苷酸和核酸代謝調(diào)節(jié)過程高度富集（圖5）。KEGG pathway分析顯示，microRNA靶基因高度富集到內(nèi)皮素（endothelins）、IFN-γ等介導(dǎo)的信號通路。

圖4 SNHG12-microRNAs-mRNAs 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖

3 討論

后基因組時代，lncRNA 已經(jīng)成為闡明癌癥復(fù)雜機(jī)制的研究重點(diǎn)[12]。lncRNA 參與一系列生物學(xué)功能[13]，迄今已有數(shù)千種lncRNA 被證實(shí)通過與其他分子的相互作用來驅(qū)動許多重要的癌癥表型[12,14-15]。帶有microRNA 結(jié)合位點(diǎn)的RNA 轉(zhuǎn)錄物可以作為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs），特異性競爭microRNA 相互作用并調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)水平[16]。ceRNA 調(diào)節(jié)模式在各種癌癥中被證實(shí)[17]，表明腫瘤發(fā)生過程中l(wèi)ncRNA和microRNA 之間存在相互作用。癌與對應(yīng)癌旁組織中具有差異表達(dá)的lncRNA、microRNA 和mRNA 可為ccRCC 中潛在生物標(biāo)志物提供更多的信息。SNHG12是小核仁RNA 宿主基因的成員，位于染色體1p35.3，在子宮內(nèi)膜癌中被首次報道在癌組織中上調(diào)[18]。SNHG12還可通過與HuR 結(jié)合，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移[19]；作為miR-424-5p的內(nèi)源性分子海綿促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[20]；通過結(jié)合miR-195-5p上調(diào)Notch2促進(jìn)骨肉瘤的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[21]；c-MYC 誘導(dǎo)SNHG12上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡，并通過調(diào)節(jié)乳腺癌中MMP13的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移[22]；在肝細(xì)胞癌中，SNHG12通過與miR-199a/b-5p作用調(diào)節(jié)MLK3的表達(dá)并影響NF-κB 途徑來促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[23]。然而，SNHG12在ccRCC 中的表達(dá)和功能尚不清楚。

圖5 microRNA 靶基因的GO 聚類分析

本研究以SNHG12為目標(biāo)基因，利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析SNHG12在ccRCC 中的差異表達(dá)，并對SNHG12進(jìn)行生存分析。結(jié)果表明，ccRCC 組織中SNHG12的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，各腫瘤分級均比正常對照表達(dá)增高，但SNHG12的表達(dá)與腫瘤分級無關(guān)，男性患者表達(dá)量高于女性患者，表達(dá)量具有性別差異，為SNHG12成為ccRCC的生物標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。此外，SNHG12高表達(dá)ccRCC 患者的總生存期明顯短于低表達(dá)患者，表明SNHG12具有作為評估ccRCC 預(yù)后的潛力。

通過功能分析和生物信息學(xué)預(yù)測探討了SN?HG12的調(diào)節(jié)信息軸。用RegRNA2.0 生物學(xué)軟件、HMDD v3.0 及starBase v3.0 數(shù) 據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)SNHG12上 存在hsa-miR-138-5p、hsa-miR-454-3p、hsamiR-497-5p這3 種 與ccRCC 相 關(guān)microRNAs 的 可能結(jié)合位點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)下游的288 個靶基因，構(gòu)成SNHG12-microRNAs-mRNAs 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它們相互作用并調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)水平，為研究SNHG12在ccRCC 中的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。microRNA 靶基因在堿基、核苷、核苷酸和核酸代謝調(diào)節(jié)過程中高度富集，表明其在生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。KEGG pathway 分析中，microRNA 參與內(nèi)皮素、IFN-γ等介導(dǎo)的信號通路，這些信號通路均與腫瘤 相 關(guān)[24]。von Brandenstein 等[25]報 道，內(nèi) 皮 素-1可誘導(dǎo)產(chǎn)生NF-κBp65/MAPKp38α/PKCα 轉(zhuǎn) 錄復(fù)合物，PKCα 通過 與pri-miRNA 莖環(huán) 結(jié)合而阻 止microRNA 成熟，從而對腎細(xì)胞癌、乳腺癌和黑色素瘤等多種腫瘤進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外，內(nèi)皮素-1 信號通路可通過EDNRA和EDNRB起作用，并在多發(fā)性骨髓瘤中過表達(dá)[26]。

本研究闡明了SNHG12具有作為ccRCC 生物標(biāo)志物的潛力，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行靶基因預(yù)測，構(gòu)建了SNHG12-microRNAs-mRNAs 相互作用網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)SNHG12在ccRCC 中的機(jī)制研究提供了借鑒。但值得注意的是，本研究仍存在一定的局限性。SNHG12的生物學(xué)作用尚未通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確定，通過生物分析軟件及在線預(yù)測軟件對lncRNA 靶標(biāo)預(yù)測可能存在假陽性，該分析結(jié)果還需要進(jìn)一步分析或?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證。