方可欣，林湘濤，華國(guó)花，王永杰，竺王玉

（舟山醫(yī)院，浙江　舟山　316021，1.細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；2.肛腸外科）

肛瘺是一種常見病和多發(fā)病，為肛周膿腫自行潰破或切開排膿后傷口經(jīng)久不愈形成，其發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)、炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖分化失衡密切相關(guān)。研究表明，IL-6水平與潰瘍性結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度相關(guān)[1]，在結(jié)腸炎潰瘍患者中IL-17A也明顯增高[2]。本研究通過對(duì)肛瘺患者外周血清炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-17A進(jìn)行分析，以期闡述肛瘺患者炎癥細(xì)胞因子對(duì)其發(fā)生發(fā)展的影響。

1　對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選取2015年9月至2016年8月間在舟山醫(yī)院接受肛瘺手術(shù)的患者49例為肛瘺組，年齡19～79歲，平均（46.6±13.2）歲，其中男42例，女7例；肛瘺病例診斷依據(jù)2006年中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)肛腸分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)結(jié)直腸肛門外科學(xué)組、中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)大腸肛門病專業(yè)委員會(huì)共同制定的《肛瘺臨床診治指南》。入選的肛瘺患者，采血前已排除激素類抗炎藥物和免疫抑制劑的使用，并且排除其他的感染性疾病或嚴(yán)重的器質(zhì)性病變。選擇同期在我院進(jìn)行體檢的48例健康者作為對(duì)照組，其性別、年齡與肛瘺組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有入組者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2試劑和儀器流式細(xì)胞儀（FACSCaliburTM，美國(guó)BD公司），試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，內(nèi)含人IL-6捕獲微球、人IL-17A捕獲微球、PE檢測(cè)試劑、細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉、流式細(xì)胞儀校正微球、PE陽(yáng)性質(zhì)控品、FITC陽(yáng)性質(zhì)控品等，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀（UniCel DXI800，美國(guó)Beckman Coulter公司），試劑為該儀器配套試劑。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集：用含分離膠和促凝劑的真空采血管采集靜脈血3 mL，肛瘺組在術(shù)前采集清晨空腹肘靜脈血，對(duì)照組于清晨空腹時(shí)采集。血清在4 h內(nèi)3000 r/min離心5 min。糖類抗原199（carbohydrate antigen 199，CA199）檢測(cè)采用電化學(xué)發(fā)光法，另取血清1 mL置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2配制標(biāo)準(zhǔn)品：將凍干的人IL-6、IL-17A標(biāo)準(zhǔn)品，室溫靜置15 min，加入2 mL實(shí)驗(yàn)稀釋液重懸，讓其自然溶解，避免劇烈震蕩，室溫平衡15 min，用移液槍輕輕地吸到流式管中。另準(zhǔn)備10根流式管，各加300 μL實(shí)驗(yàn)稀釋液。用槍頭輕微地混勻標(biāo)準(zhǔn)品，依次稀釋1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶216、1∶512、0∶1。

1.3.3混合微球：每種微球旋渦振蕩幾秒后，取10 μL/管×測(cè)量管數(shù)的量，即為每管微球的總量，一共7種微球。充分混合后1500 r/min離心5 min，加入與上清相同體積的血清增強(qiáng)緩沖液，旋渦充分混勻。室溫避光孵育30 min。在所有測(cè)試管中加入50 μL PE檢測(cè)試劑，50 μL孵育后的捕獲微球混合液。在標(biāo)準(zhǔn)品管中加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品，樣本管中每管加入50 μL樣本。將混合后的測(cè)試管避光孵育3 h后，用1 mL洗滌液洗滌，1500 r/min離心5 min，小心吸出各檢測(cè)管的上清棄去。每管加300 μL洗液，旋渦振蕩重懸細(xì)胞。FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀至少檢測(cè)1×105個(gè)細(xì)胞。所用檢測(cè)軟件為CellQuest自動(dòng)軟件。CBA軟件（美國(guó)BD公司）對(duì)數(shù)據(jù)做分析。

1.3.4肛瘺壁病理學(xué)檢查：肛瘺病理切片應(yīng)用HE染色，每個(gè)患者有2張或2張以上HE染色病理切片，由2位高年資病理醫(yī)師閱片，判定是否符合肛瘺病理學(xué)改變。

1.3.5肛瘺膿液細(xì)菌培養(yǎng)：將肛管直腸下端黏膜切開后，用無菌棉拭自肛瘺深部取樣，立即送微生物室檢驗(yàn)。細(xì)菌培養(yǎng)嚴(yán)格按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版臨床微生物常規(guī)鑒定程序操作，采用Phoenix100或ATB-expression細(xì)菌鑒定儀對(duì)相應(yīng)病原菌進(jìn)行鑒定。

也正是冤家路窄，柳紅驚恐萬狀地竄出玉米地，就瞧見那個(gè)偷瓜賊抱著一只大西瓜，篤悠悠地朝玉米地走來，他大概也把這片玉米地當(dāng)作掩護(hù)偷盜的天然屏障了。癩阿小走到玉米地邊上，剛想松口氣的當(dāng)兒，柳紅突然從玉米地里跳將出，沖他大喝一聲。與其說他是被柳紅嚇倒了，倒不如說是被這種突發(fā)性的狀況所嚇倒了；癩阿小見到柳紅就跟見到鬼似的。不由自主地扔下那只大西瓜，轉(zhuǎn)身就跑。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS17.0和GraphPad Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料為正態(tài)分布時(shí)，以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；為偏態(tài)分布時(shí)，以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肛瘺患者外周血清IL-6、IL-17A水平肛瘺組外周血清IL-6水平明顯高于對(duì)照組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），但肛瘺組外周血清IL-17A水平與對(duì)照組比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.521），見表1。觀察肛瘺患者肛瘺壁的病理現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)肛瘺組外周血清IL-6和IL-17A表達(dá)水平正常者，肛瘺壁僅少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，而對(duì)于IL-6和IL-17A表達(dá)水平增高者，肛瘺壁則出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。

2.2肛瘺患者外周血清IL-6、IL-17A的相關(guān)性及與CA199關(guān)系在對(duì)照組外周血清中，IL-6與IL-17A及IL-6、IL-17A與CA199間均無明顯的相關(guān)性（P=0.234、0.455、0.506），見圖2A-C。對(duì)肛瘺組外周血清IL-6、IL-17A水平相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，IL-6與IL-17A并不具有明顯的相關(guān)性（r=0.262，P=0.069），見圖2D；IL-6與肛瘺組CA199水平具有明顯的相關(guān)性（r=0.629，P＜0.001），見圖2E，而CA199與IL-17A則無明顯的相關(guān)性（r=0.068，P=0.647），見圖2F。

表1　肛瘺患者與正常體檢者外周血清細(xì)胞因子表達(dá)水平[M（P25，P75），pg/mL]

圖1　肛瘺患者肛瘺壁病理學(xué)表現(xiàn)（HE）

2.3肛瘺組外周血清IL-6、IL-17A與臨床特征的關(guān)系在49例肛瘺組患者中，25例存在肛瘺膿液，23例膿液細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性，病原菌檢出陽(yáng)性率為47.9%，共檢出病原菌23株，其中大腸埃希菌為12株（占52.2%），肺炎克雷伯菌肺炎亞種4株（占17.4%），陰溝腸桿菌2株（占8.7%），其余為金黃色葡萄球菌、白假絲酵母、糞腸球菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、銅綠假單胞菌各1株（占4.3%）。對(duì)肛瘺患者外周清IL-6、IL-17A水平與臨床特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示肛瘺中存在膿液及膿液細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性的患者IL-6水平明顯高于肛瘺中無膿液及膿液細(xì)菌培養(yǎng)陰性的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008、0.001），見表2。

3　討論

肛瘺是一種難治性疾病，給患者的生活健康帶來非常不利的影響。盡管肛瘺發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但免疫反應(yīng)可能是其中一個(gè)重要因素。細(xì)菌定植于肛周黏膜后，啟動(dòng)免疫反應(yīng)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥發(fā)生，最終導(dǎo)致瘺管生成。評(píng)估肛瘺患者的免疫狀態(tài)，對(duì)判斷疾病進(jìn)展具有重要的臨床意義。

IL-6可由活化的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或其他細(xì)胞分泌，通過經(jīng)典信號(hào)或反式信號(hào)途徑激活靶因子。經(jīng)典信號(hào)中IL-6與膜表面IL-6受體結(jié)合后，與糖蛋白130進(jìn)一步結(jié)合成二聚體，從而激活下游信號(hào)通路；反式信號(hào)則通過IL-6與游離IL-6受體結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄因子STAT-3，STAT-3繼而誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-2，激活T細(xì)胞抗凋亡，從而導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生[2-3]。多項(xiàng)研究表明，外周血清IL-6在炎癥性腸道疾病中表達(dá)增高，并且與疾病活動(dòng)度密切相關(guān)[4-5]。VAN KEMSEKE等[6]研究認(rèn)為血清IL-6水平增高可作為靜止期克羅恩病復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。在肛瘺患者中，本研究結(jié)果也提示其血清IL-6水平增高顯著，并且肛瘺中存在膿液或膿液中細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性的患者IL-6水平明顯增高。與腸道炎癥相似，IL-6也可作為一個(gè)評(píng)估指標(biāo)評(píng)估肛瘺的發(fā)生發(fā)展情況。

研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞中的IL-6信號(hào)可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子RAR相關(guān)的孤兒受體γt表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)IL-17A水平的增高，參與Th17細(xì)胞的分化[7]。多項(xiàng)研究表明IL-17參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生進(jìn)展，在感染旋毛蟲的腸易激綜合征患者腸黏膜IL-17A表達(dá)亦增高[8-10]。然而，IL-17A在肛瘺患者中表達(dá)是否增高并不明確。本研究結(jié)果顯示在肛瘺患者中，血清IL-17A表達(dá)水平?jīng)]有升高，而且相關(guān)性分析顯示IL-6與IL-17A也無明顯相關(guān)性，與相關(guān)研究結(jié)果不同[7]，可能是由于個(gè)體差異及研究方法的不同造成的。但病理學(xué)檢查顯示IL-6與IL-17A水平均增高患者肛瘺壁出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，IL-6與IL-17A在促進(jìn)炎癥的發(fā)生中可能具有一定的協(xié)同作用。

另外，本結(jié)果還顯示肛瘺患者外周血清IL-6與CA199具有一定的相關(guān)性。CA199為常用的與胃腸道腫瘤相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，在發(fā)生腸道腫瘤時(shí)CA199呈現(xiàn)一定程度的增高，而IL-6在結(jié)腸癌患者中亦有一定程度的增高[11]。研究還發(fā)現(xiàn)深層T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌IL-6，激活STATL-3，并促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[12]。因此，外周血清IL-6增高肛瘺患者應(yīng)密切監(jiān)視CA199水平。

圖2　肛瘺患者外周血清IL-6、IL-17A、CA199的相關(guān)性分析

表2　肛瘺患者外周血清IL-6、IL-17A與臨床特征的關(guān)系[M（P25，P75）]

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