趙俊云,楊曉敏,趙丕文
(北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)
丹參酮ⅡA是從中藥丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)及其同屬植物中分離得到的一類脂溶性化合物,其在體內(nèi)外都表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性,可抑制包括乳腺癌、肺癌、肝癌、白血病、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞株的體外增殖[1-7]。本研究旨在探討丹參酮ⅡA對乳腺癌細(xì)胞系T47D、MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響,并從環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)及其主要轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白-1(AP-1)的活性探討丹參酮ⅡA抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的分子機制。
1.1實驗材料丹參酮ⅡA購自成都曼思特生物科技有限公司;塞來昔布(Celecoxib)購自Pfizer Pharmaceuticals LLC;乳腺癌細(xì)胞系T47D、MCF-7、MDA-MB-231、5種質(zhì)粒(pCOX2-Luc、pNFκB-Luc 、pAP1-Luc、pRL-CMV、EGFP質(zhì)粒)均為本實驗室保存;Anti-human COX-2 antibody 購自Cell Signaling Technology;DMEM/High Glucose購自Hyclone;Fetal Bovine Serum、0.25%Trypsin-EDTA、Anti-anti、Lipofectamine 2000 Reagent均購自Invitrogen;MTT干粉購自Sigma;Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega;LB液體培養(yǎng)基(干粉)、氨芐青霉素干粉、卡那霉素干粉均購自北京索萊寶科技有限公司;無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。
1.2主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(Binder生產(chǎn),型號:XMTG-908),超凈工作臺(北京昌平長城空氣凈化工程公司生產(chǎn)),倒置顯微鏡(Olympus生產(chǎn),型號:CKX41),酶標(biāo)儀(Tecan生產(chǎn),型號:Safire2),高速冷凍離心機(Eppendorf生產(chǎn),型號:3K15),熒光顯微鏡(Nikon生產(chǎn),型號:TE2000),發(fā)光檢測儀(Promega生產(chǎn),型號:Glomax Multi Detection System)。
1.3實驗方法
1.3.1MTT實驗常規(guī)培養(yǎng)T47D、MCF-7、MDA-MB-231,使用含EDTA的0.25%胰蛋白酶工作液消化細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液,于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種200 μL細(xì)胞懸液,每孔約含4×104個細(xì)胞,培養(yǎng)24 h。除對照組外,丹參酮ⅡA 1~5組分別加入丹參酮ⅡA至終濃度為10-6mol/L、5×10-6mol/L、10-5mol/L、5×10-5mol/L 、10-4mol/L,每組設(shè)5復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT,孵育4~6 h后,每孔吸棄上清液100 μL,每孔加入150 μL DMSO,避光混勻15 min,酶標(biāo)儀檢測OD570,計算抑制率。
1.3.2Westernblot檢測常規(guī)培養(yǎng)T47D、MCF-7、MDA-MB-231,使用含EDTA的0.25%胰蛋白酶工作液消化細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液,于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種2 mL細(xì)胞懸液,每孔約含5×105個細(xì)胞,培養(yǎng)24 h。除對照組外,丹參酮ⅡA組分別加入丹參酮ⅡA至終濃度為5×10-5mol/L;于培養(yǎng)48 h后裂解細(xì)胞,提取總蛋白,定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)移電泳,封閉后,加入稀釋后的Anti-human COX-2 antibody孵育過夜,二抗孵育1 h后曝光顯影。
1.3.3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實驗按照常規(guī)方法擴增質(zhì)粒,pCOX2-Luc、pNFκB-Luc、pAP1-Luc、pRL-CMV使用含0.1 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液,EGFP質(zhì)粒使用含0.05 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液。搖床培養(yǎng)菌液24 h后,按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒說明抽提質(zhì)粒,使用紫外分光光度計測定各種質(zhì)粒的純度及濃度,-20 ℃保存?zhèn)溆?。?6孔板中每孔接種200 μL細(xì)胞懸液,每孔約含8×104個細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞密度達(dá)90%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將EGFP質(zhì)粒與適量轉(zhuǎn)染試劑用無血清無抗生素DMEM混勻,室溫孵育20 min后,按比例加入96孔板中,并設(shè)5孔未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照組。培養(yǎng)36 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光,估計細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。于48孔板中每孔接種250 μL細(xì)胞懸液,每孔約含2×105個細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞密度達(dá)90%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將pCOX2-Luc與pRL-CMV分別按10∶1,100∶1,1 000∶1比例混合,再用無血清無抗生素DMEM與適量轉(zhuǎn)染試劑混勻,室溫孵育20 min后,按比例加入48孔板中,并設(shè)5孔未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照。同樣方法進(jìn)行pNFκB-Luc與pRL-CMV、pAP1-Luc與pRL-CMV雙轉(zhuǎn)染。
1.3.4雙熒光素酶報告基因檢測培養(yǎng)48 h后,按Dual-Luciferase Reporter Assay System說明處理細(xì)胞,在發(fā)光檢測儀上分別讀取螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性數(shù)值,計算比值。選取適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒比例,再次進(jìn)行細(xì)胞的雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,同時加入一定量的丹參酮ⅡA處理,培養(yǎng)48 h后,在發(fā)光檢測儀上讀取熒光素酶活性數(shù)值,計算比值。
2.1丹參酮ⅡA對乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響MTT實驗結(jié)果顯示,丹參酮ⅡA對T47D、MCF-7、MDA-MB-231的體外增殖有抑制作用,且抑制率與丹參酮ⅡA的濃度及作用時長呈正相關(guān)。見表1~3。綜合考慮藥效及細(xì)胞存活數(shù)量,選取抑制率接近50%的5×10-5mol/L作用48 h作為后續(xù)實驗中丹參酮ⅡA的濃度與作用時長。
表1 丹參酮ⅡA對T47D增殖的影響
表2 丹參酮ⅡA對MCF-7增殖的影響
表3 丹參酮ⅡA對MDA-MB-231增殖的影響
2.2丹參酮ⅡA對乳腺癌細(xì)胞COX-2蛋白水平的影響使用終濃度為5×10-5mol/L的丹參酮ⅡA處理3種乳腺癌細(xì)胞48 h后,與對照組相比,3種細(xì)胞中COX-2的蛋白水平均明顯降低。見圖1。
圖1 3種乳腺癌細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)水平
2.3丹參酮ⅡA對乳腺癌細(xì)胞COX-2轉(zhuǎn)錄活性的影響使用終濃度為5×10-5mol/L的丹參酮ⅡA處理轉(zhuǎn)染(pCOX2-Luc∶pRL-CMV=100∶1)后的3種乳腺癌細(xì)胞48 h后,與對照組相比,T47D和MCF-7細(xì)胞丹參酮ⅡA組的比值顯著降低(P均<0.05)。見表4。
表4 丹參酮ⅡA對乳腺癌細(xì)胞COX-2轉(zhuǎn)錄活性的影響
注:①與對照組比較,P<0.05。
2.4丹參酮ⅡA對乳腺癌細(xì)胞NF-κB活性的影響使用終濃度為5×10-5mol/L的丹參酮ⅡA處理轉(zhuǎn)染(pNFκB-Luc∶pRL-CMV=1 000∶1)后的3種乳腺癌細(xì)胞48 h后,與對照組相比,T47D和MCF-7細(xì)胞丹參酮ⅡA組的比值顯著降低(P均<0.05)。見表5。
表5 丹參酮ⅡA對乳腺癌細(xì)胞NF-κB活性的影響
注:①與對照組比較,P<0.05。
2.5丹參酮ⅡA對乳腺癌細(xì)胞AP-1活性的影響使用終濃度為5×10-5mol/L的丹參酮ⅡA處理轉(zhuǎn)染(pAP1-Luc∶pRL-CMV=1 000∶1)后的3種乳腺癌細(xì)胞48 h后,與對照組相比,3種細(xì)胞丹參酮ⅡA組的比值均顯著降低(P均<0.05)。見表6。
表6 丹參酮ⅡA對乳腺癌細(xì)胞AP-1活性的影響
注:①與對照組比較,P<0.05。
丹參酮ⅡA是一種被證實具有抗腫瘤活性的中藥小分子單體化合物,可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等多途徑發(fā)揮抗腫瘤作用,其與某些化療藥物合用有減毒增效的作用[1-7]。本研究使用了3種乳腺癌細(xì)胞系,其中T47D和MCF-7是雌激素受體陽性細(xì)胞系,MDA-MB-231是三陰性細(xì)胞系,這3種乳腺癌細(xì)胞均有COX-2高表達(dá)的特性。丹參酮ⅡA等中藥單體對乳腺癌細(xì)胞系的抑制作用與雌激素受體陽性與否并無明顯關(guān)系。因此本文著重探討丹參酮ⅡA對與腫瘤密切相關(guān)的炎癥通路COX-2的抑制作用,進(jìn)一步闡明丹參酮ⅡA的抗腫瘤機制。
乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一,乳腺癌的預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)及治療可有效降低群體發(fā)病率和提高患者生存質(zhì)量。目前乳腺癌的治療手段主要有手術(shù)治療、放化療、生物治療等,對乳腺癌進(jìn)行早期篩查診斷,并輔以抗腫瘤天然藥物干預(yù),可有效改善患者的生存質(zhì)量。本研究結(jié)果顯示丹參酮ⅡA可有效抑制乳腺癌細(xì)胞的體外增殖,且呈明顯的量效關(guān)系和時間依賴性,其中終濃度5×10-6mol/L的丹參酮ⅡA處理乳腺癌細(xì)胞48 h后能達(dá)到近50%的抑制率,較低的濃度及其適當(dāng)?shù)钠鹦r間顯示了丹參酮ⅡA在腫瘤治療中的應(yīng)用前景。COX-2是COX家族的重要成員。COX主要有3種同工酶,其中COX-1是一種持續(xù)表達(dá)的結(jié)構(gòu)酶,發(fā)揮看家作用,主要調(diào)節(jié)生理性前列腺素合成[8];COX-3是一種新型剪接異構(gòu)體,與COX-1源于同一基因,主要在心、腦組織持續(xù)表達(dá)[9];COX-2又稱誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶,在正常生理狀態(tài)下多數(shù)組織不表達(dá)或低表達(dá),但在生長因子、內(nèi)毒素及腫瘤促進(jìn)因子的作用下呈誘導(dǎo)性表達(dá),尤其是在腫瘤組織中,COX-2的表達(dá)普遍有增強趨勢[8]。除此之外,COX-2還是重要的細(xì)胞凋亡抑制因子,與腫瘤細(xì)胞的命運密切相關(guān)。大量研究表明,COX-2可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤血管形成以及增強腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,從而促進(jìn)腫瘤的形成與發(fā)展[10-12]。相關(guān)臨床資料也表明,COX-2 與腫癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切, 對于腫瘤的早期診斷及預(yù)后預(yù)測有重要意義, 是多種腫瘤治療藥物的重要靶點之一[13]。COX-2抑制劑目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床治療。本研究發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA可顯著降低乳腺癌細(xì)胞COX-2的蛋白水平,且在啟動子水平有效抑制COX-2的轉(zhuǎn)錄,這顯示了丹參酮ⅡA在抑制乳腺癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù)防中的應(yīng)用前景。與T47D、MCF-7不同,MDA-MB-231在COX-2轉(zhuǎn)錄水平上的降低不顯著,提示雌激素受體存在與否與丹參酮ⅡA對COX-2轉(zhuǎn)錄水平的影響有相關(guān)性。
COX-2基因的啟動子序列上游除1個保守的啟動子序列TATA盒以外,還包含一些早期應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件,如轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1的結(jié)合位點[8]。NF-κB可調(diào)控參與免疫反應(yīng)早期和炎癥反應(yīng)各階段的許多分子的調(diào)控,包括COX-2。AP-1是炎癥、腫瘤等情況下調(diào)節(jié)COX-2表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子,主要以磷酸化c-jun/c-fos二聚體形式與AP-1位點結(jié)合進(jìn)而增強COX-2的轉(zhuǎn)錄水平[14]。本研究中使用位點質(zhì)粒pAP1-Luc和pNFκB-Luc,可以直觀顯示發(fā)揮轉(zhuǎn)錄增強作用的NF-κB、AP-1位點的活性。實驗結(jié)果顯示丹參酮ⅡA可有效降低乳腺癌細(xì)胞中該位點的活性。值得注意的是,丹參酮ⅡA主要對AP-1位點的活性有顯著降低,對于MDA-MB-231中NF-κB位點的活性無明顯改變,結(jié)合上述結(jié)果,可以推測丹參酮ⅡA作用于MDA-MB-231的機制不同于T47D、MCF-7,這是否與雌激素受體有無相關(guān)還有待驗證。對于轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及丹參酮ⅡA對其的干預(yù),還將在后續(xù)工作中進(jìn)一步探討。
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