尹明華　鄧紅根　蔣　妍　萬　琳　吳麗霞　凌　飛　汪金華

(上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，上饒　334001)

薯蕷屬(DioscoreaL.)為單子葉植物綱、薯蕷科(Dioscoreaceae)中最大的一個屬。我國薯蕷屬植物分為6個組，即根狀莖組、丁字形毛組、頂生翅組、基生翅組、復(fù)葉組、周生翅組。黃獨(D.bulbiferaL.)屬于基生翅組，其地下塊莖黃藥子，含有diosbulbin A-H 8種黃獨素，還含有黃酮類、蒽醌類、鞣質(zhì)及糖類、淀粉等，具有涼血，降火，消癭，解毒等功效，主治甲狀腺腫大、咽喉腫痛、咯血、百日咳等病，也可用于多種癌癥的治療[1]。由于黃獨野生種質(zhì)資源的過度開采和使用，其產(chǎn)量已逐年萎縮，且多采用營養(yǎng)繁殖的方法進行栽培，病毒感染嚴重，品質(zhì)也在不斷退化。因此，對黃獨種質(zhì)資源實施有效保存已迫在眉睫。離體保存技術(shù)克服了傳統(tǒng)種植保存占用土地、易受病蟲害和自然災(zāi)害的影響、管理費用高等缺點，具有占用空間小、可排除病蟲和病毒等的侵染、生產(chǎn)上需要即可快速地大量繁殖、費用低廉等優(yōu)點，目前受到廣泛的關(guān)注和重視[2]。離體保存主要有超低溫和低溫二種方式。超低溫保存是將材料貯存在液氮中，是一種比較穩(wěn)妥的長期保存種質(zhì)的方法；而低溫保存則是通過降低溫度，抑制植物材料的生長，從而延長其繼代時間，與超低溫保存比起來，具有簡單方便、操作容易，適合用于植物種質(zhì)資源的中短期保存[3]。

微型塊莖又稱零余子，是薯蕷屬植物腋芽形成的變態(tài)塊莖，也俗稱“珠芽”，具有體積小，便于儲存和運輸?shù)葍?yōu)點，常作為大田種植的繁殖材料，尤其是利用脫毒苗獲得的脫毒微型塊莖更是優(yōu)質(zhì)種苗的重要來源[4]。目前，對薯蕷屬植物微型塊莖的誘導(dǎo)[5～11]、休眠和萌發(fā)[12]多有報道，但關(guān)于薯蕷屬微型塊莖的低溫保存研究極少，在國內(nèi)，韋本輝等[13]對淮山微型塊莖的低溫保存進行了研究；在國外，Ovono等[14]對山藥(Dioscoreacayenensis-D.rotundatacomplex)的微型塊莖進行了低溫(18℃)保存，指出其微型塊莖在18℃下低溫保存2～4周后需要24周以上的時間才能萌發(fā)。我們對黃獨微型塊莖的低溫保存進行了前期研究，對其低溫保存期間的解剖結(jié)構(gòu)、生理生化指標進行了檢測[15]，但植物低溫脅迫下會產(chǎn)生自身免疫應(yīng)答反應(yīng)，代謝物在這種免疫反應(yīng)中扮演著非常重要的角色。代謝產(chǎn)物的水平可以被看作生物系統(tǒng)對遺傳或環(huán)境變化的最終響應(yīng)，有利于更直觀有效地了解生物學(xué)過程及其機理[16]。代謝組學(xué)是研究生物體或者組織甚至單個細胞的全部小分子代謝物成分及其隨時間變化而變化的學(xué)科[17]。在眾多代謝組學(xué)分析技術(shù)中，氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)較為成熟，分辨率高、靈敏度高、重現(xiàn)性好，擁有大量標準質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫且成本相對低廉，很早就應(yīng)用到植物代謝組學(xué)研究領(lǐng)域，迄今仍然是主要分析平臺之一[18]。目前，低溫對模式植物擬南芥代謝的影響研究較深入。Cook等[19]使用GC-TOF/MS大規(guī)模研究擬南芥冷害的代謝應(yīng)答途徑，結(jié)果表明冷馴化與代謝組密切相關(guān)。在黃獨微型塊莖的低溫保存過程中，其代謝產(chǎn)物的水平有何變化尚未見相關(guān)報道。本文以黃獨微型塊莖為研究對象，基于GC-MS的代謝組學(xué)方法，結(jié)合統(tǒng)計學(xué)與生物信息學(xué)分析手段，對其低溫保存的代謝組學(xué)進行分析，旨在為黃獨微型塊莖的低溫離體保存以及其后續(xù)萌發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材料和儀器

黃獨微型塊莖(上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室提供)。

1.2　方法

1.2.1微型塊莖的誘導(dǎo)及其低溫離體保存

利用黃獨試管苗的帶芽莖段，接種到MS+KT 2 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖60 g·L-1的液體培養(yǎng)基中，使其誘導(dǎo)出微型塊莖，然后挑選出直徑約0.5 cm的微型塊莖轉(zhuǎn)移到無菌100 mL三角瓶(空瓶)中，然后進行4℃低溫離體保存。試驗材料分成4℃處理組(以Con4表示)和25℃對照組(以Con25表示)，保存60 d后進行GC-MS代謝組學(xué)檢測。

1.2.2低溫離體保存微型塊莖的代謝組學(xué)檢測

把以上兩組試驗樣品100 mg在液氮中磨碎，并轉(zhuǎn)移到10 mL離心管，加入1 400 μL 100%的甲醇(預(yù)冷至-20℃)，然后渦旋振蕩30 s，60 μL的核糖醇(0.2 mg·mL-1)作為內(nèi)標，渦旋振蕩30 s，放入超聲波清洗機處理15 min，加入750 μL氯仿與1 400 μL水震蕩混合混勻，4 000 r·min-1離心15 min,上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管，樣品用氮氣吹干,加入60 μL甲氧基吡啶溶液(15 mg·mL-1)渦旋振蕩30 s，過夜反應(yīng)16 h。最后，加入60 μL BSTFA試劑(含1%三甲基氯硅烷)，常溫條件下反應(yīng)60 min。經(jīng)過以上的反應(yīng)，為次生代謝物含量的樣品進行了測定，使用檢測設(shè)備為Agilent 7890A/5975C 氣—質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫，美國)。GC/MS檢測程序：色譜條件：色譜柱HP-5MS毛細管柱(5% phenyl methyl silox：30 m×250 μm i.d.，0.25 μm；agilent J&W scientific，F(xiàn)olsom，CA)；分流進樣，進樣量1 μL，分流比20∶1。進樣口溫度280℃；離子源溫度250℃；接口溫度150℃。程序升溫起始溫度40℃；保持5 min，以10℃·min-1升至300℃，保持5 min。載氣為氦氣，流速1 mL·min-1。MS條件：電噴霧電離(ESI)源，全掃描方式，電子能量70eV；四極桿掃描范圍m/z 35-780。

1.2.3數(shù)據(jù)處理和分析

利用GC-MS預(yù)處理軟件XCMS(www.bioconductor.org/)對Agilent 7890A/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測獲得的原始文件進行數(shù)據(jù)預(yù)處理。首先從Agilent MSD ChemStation工作站獲得的原始的GC/MS數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成CDF格式(Net CDF)。然后利用XCMS程序進行峰識別、峰過濾、峰對齊等工作，逐一考察及優(yōu)化了各個參數(shù)，并通過手動提取任意質(zhì)量色譜峰來驗證結(jié)果的準確性，最終確定了XCMS的各個參數(shù)。除了XCMS默認的參數(shù)以外進行了如下的調(diào)整：xcmsSet(fwhm=3，snthresh=3，mzdiff=0.5，step=0.1，steps=2，ma=300)，retcor(method=“obiwarp”，plottype=c(“deviation”))，bandwidth(bw)為2，minfrac=0.3。為了分析多元線性回歸，XCMS的最終結(jié)果導(dǎo)出至EXCLE進行進一步的分析。對原始數(shù)據(jù)進行歸一化處理，方法是內(nèi)標法(ribitol))。對樣本進行信息比對分析，并對得到數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，分析包括：數(shù)據(jù)預(yù)處理，化合物鑒定，主成分分析(PCA分析)，偏最小二乘法—判別分析(PLS-DA分析)，差異化合物篩選。

2　結(jié)果與分析

2.1　代謝物注釋

對上述獲得的保留時間、質(zhì)核比及峰強的矩陣(共213個變量)進行代謝物的注釋，注釋所用數(shù)據(jù)庫為NIST商業(yè)數(shù)據(jù)庫(NIST 2008)和wiley 9代謝組數(shù)據(jù)庫。最終獲得90個可以被數(shù)據(jù)庫注釋的變量。大量的物質(zhì)由于信號低或者沒有數(shù)據(jù)庫收錄而沒有被注釋到。

2.2　所有樣本主成分分析(PCA)

首先對所有樣本進行主成分分析。在Simca-P 11.0軟件中，數(shù)據(jù)采用Par變換，首先進行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)進行無監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析，觀察各族數(shù)據(jù)的聚類并去除離群樣本。結(jié)果表明，R2X為0.598，Q2為-0.004 5，由此可以推斷模型質(zhì)量較好，擬合處理能夠有效的找出樣品分類的最大差異，適合做后續(xù)分析。兩組PCA得分圖(Scores plot)如圖1所示，樣本基本都處于95%置信區(qū)間(Hotelling T2 ellipse)內(nèi)。

圖1　處理組和對照組PCA得分圖Fig.1　PCA score chart of treatment group and control group

2.3　所有樣本偏最小二乘方—判別分析(PLS-DA)

用偏最小二乘判別分析(Partial Least Squares-Discriminant Analysis,PLS-DA)進行有監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析，并采用置換檢驗(permutation test)防止PLS-DA模型的過度擬合。并進一步通過PLS-DA模型變量的VIP值(Variable Importance on Projection)對差異變量進行篩選。本節(jié)采用PLS-DA這種監(jiān)督的多維統(tǒng)計分析方法對這樣本進行模型分析。并進一步對模型的質(zhì)量用交叉驗證法進行檢驗，并用交叉驗證后得到的R2X和Q2(分別代表模型可解釋的變量及模型的可預(yù)測度)對模型有效性進行評判。結(jié)果表明，R2X為0.451，R2Y為0.954，Q2為0.688。得分圖如圖2所示(橫坐標為第1主成分得分，用t表示；縱坐標為第2主成分得分，用t表示)。R2Y(即監(jiān)督模型的解釋率)說明PLS-DA模型已經(jīng)可以很好地解釋各組樣本之間的差異。在此之后，對于PLS-DA模型進行置換檢驗(permutation test)，100次驗證結(jié)果顯示R2在Y軸上的截距為0.654，Q2在Y軸上的截距為-0.319(圖3)。從各組的模型預(yù)測參數(shù)的R2X、R2Y、Q2Y來看，上述的模型是有效和可靠的，因其符合以下標準[20]：Q2Y>0.5被認為是有效的模型，Q2Y>0.9被認為是出色的模型，0

在載荷圖中(Loading plot)中(圖4)，離原點越遠的點表示對各組分類的貢獻越大。

圖2　處理組和對照組的PLS-DA得分圖Fig.2　PLS-DA score chart of treatment group and control group

圖3　處理組和對照組的PLS-DA置換檢驗圖Fig.3　PLS-DA permutation test chart of treatment group and control group

圖4　處理組和對照組的PLS-DA載荷圖Fig.4　PLS-DA loading plot of treatment group and control group

2.4　所有樣本熱圖分析

對獲得的代謝物進行樣本和代謝物的雙向聚類，所用方法為：層次聚類。從圖5可以看出哪些樣本具有相似的代謝譜，哪些代謝物具有相似的代謝方式，并聚集在一起，聚類軟件為R語言(www.r-project.org)包Pheatmap。

2.5　代謝物關(guān)聯(lián)性分析

對所有的代謝物進行時間序列的關(guān)聯(lián)性分析，采用方法為皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficients)分析，關(guān)聯(lián)性矩陣用R語言的pheatmap包進行熱圖的繪制(圖6)。代謝物之間的相關(guān)系數(shù)的計算同時綜合了所有時間點。其中1為表示完全正相關(guān)，-1為表示完全負相關(guān)。

圖5　處理組和對照組代謝物熱圖分析Fig.5　Thermal analysis of treatment group and control group

2.6　差異顯著的代謝物

采用學(xué)生氏T檢驗來尋找差異代謝物，閾值為P<0.05，并結(jié)合倍第一主成分的VIP值(Variable Importance in the Projection)來判斷差異的代謝物(FC>=1.5或者FC<0.75)，差異結(jié)果見表1。處理組和對照組的差異性代謝物有丙氨酸(Alanine)、兒茶素(Catechin)、檸檬酸(Citric acid)、N,N-雙(2-羥乙基)甲胺(N,N-Di-(2-Hydroxyethyl)-methanamine)、水楊酸(Salicylic acid)和山梨糖(Sorbose)。

圖6　處理組和對照組代謝物×代謝物相關(guān)性分析Fig.6　Correlation analysis of metabolites×metabolites of treatment group and control group

Table2KEGGcommentsofdifferentialmetabolites

查詢Query匹配Match人類代謝組數(shù)據(jù)庫HMDB有機小分子生物活性數(shù)據(jù)PubChem京都基因與基因組百科全書KEGG注釋CommentAlanineAlanineMETPA0179NAC014011CatechinCatechinHMDB027809064C065621N,N-Di-(2-Hydroxyethyl)-methanamineNANANANA0SalicylicacidSalicylicacidHMDB01895338C008051SorboseL-SorboseHMDB01266441484C083561

注：1.確切注釋；2.有疑問；0.無注釋

Note:1. The exact notes; 2. A question; 0. No comment

2.7　差異代謝物的KEGG注釋

對差異代謝物進行KEGG compound名稱注釋。獲得KEGG compound ID(表2)。并進行KEGG pathway注釋工作。獲得KEGG pathway(表3)。在黃獨微型塊莖4℃離體保存中，丙氨酸(Alanine)參與氰基氨基酸代謝；兒茶素(Catechin)參與次生代謝產(chǎn)物生物合成、黃酮類化合物的生物合成和苯丙素的生物合成；水楊酸(Salicylic acid)參與多環(huán)芳烴降解、微生物在不同環(huán)境中的代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝產(chǎn)物生物合成、二惡英降解、苯丙氨酸代謝、芳烴降解、植物激素生物合成、鐵載體組非核糖體肽合成和苯丙素的生物合成等。檸檬酸(Citric acid)參與來自鳥氨酸、賴氨酸和煙酸的生物堿生物合成、組氨酸和嘌呤的生物堿生物合成、微生物在不同環(huán)境中的代謝、植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成、2-氧代羧酸代謝、萜類和類固醇的生物合成、原核生物固碳途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、 來自莽草酸途徑的生物堿生物合成、來自萜類化合物和聚酮的生物堿生物合成、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、植物激素生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、雙組分系統(tǒng)、苯丙素的生物合成以及來自鳥氨酸，賴氨酸和煙酸的生物堿生物合成等。

表3　差異代謝物的KEGG pathway注釋

3　討論

代謝組學(xué)為較為全面地研究植物復(fù)雜代謝過程及其產(chǎn)物，從而為分析植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、限速步驟，解析細胞活動過程，是研究植物體內(nèi)復(fù)雜生理代謝物的波動是一種非常有效的方法[21]。本研究通過對黃獨低溫離體保存的微型塊莖進行GC/MS代謝組學(xué)分析，結(jié)果表明，與黃獨微型塊莖25℃離體保存相比較，黃獨微型塊莖4℃離體保存的差異性代謝物有丙氨酸(Alanine)、兒茶素(Catechin)、N,N-雙(2-羥乙基)甲胺(N,N-Di-(2-Hydroxyethyl)-methanamine)、水楊酸(Salicylic acid)和山梨糖(Sorbose)。

其中，丙氨酸(Alanine)在黃獨微型塊莖低溫離體保存中主要參與氰基氨基酸代謝；兒茶素(Catechin)是主要的類黃酮化合物之一，具有抗氧化、抗誘變、抗癌、抗心血管疾病、紫外線輻射的保護作用以及抗糖尿病、抗菌消炎、減肥和帕金森病的治療等作用[22]。在黃獨微型塊莖低溫離體保存中主要參與次生代謝產(chǎn)物生物合成、黃酮類化合物的生物合成和苯丙素的生物合成。

水楊酸(Salicylic acid)是植物體內(nèi)普遍存在的一種酚類化合物，可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性[23]。水楊酸可以提高植物抵抗高溫、低溫、鹽害、重金屬及干旱等逆境的能力，還可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性[24]。在黃獨微型塊莖低溫離體保存中主要參與多環(huán)芳烴降解、微生物在不同環(huán)境中的代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝產(chǎn)物生物合成、二惡英降解、苯丙氨酸代謝、芳烴降解、植物激素生物合成、鐵載體組非核糖體肽合成和苯丙素的生物合成等。

檸檬酸(Citric acid)代謝涉及到檸檬酸合成與降解二個方面，其合成途徑以三羧酸(TCA)循環(huán)為主，其降解有γ-氨基丁酸(GABA)途徑和谷氨酰胺合成酶(GS)途徑。檸檬酸代謝涉及到許多不同的酶，主要有檸檬酸合成酶、順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶等[25]。同時，檸檬酸作為植物體內(nèi)廣泛存在的一類生物小分子，可以為植物細胞提供質(zhì)子，從而啟動很多代謝反應(yīng)，與植物逆境生理密切相關(guān)，是植物體內(nèi)關(guān)鍵的代謝物，參與C4循環(huán)等眾多代謝途徑，可以顯著提高植物體的耐酸性和對逆境的抗性[26]。在黃獨微型塊莖低溫離體保存中主要參與來自鳥氨酸、賴氨酸和煙酸的生物堿生物合成、組氨酸和嘌呤的生物堿生物合成、微生物在不同環(huán)境中的代謝、植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成、2-氧代羧酸代謝、萜類和類固醇的生物合成、原核生物固碳途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、來自莽草酸途徑的生物堿生物合成、來自萜類化合物和聚酮的生物堿生物合成、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、植物激素生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、雙組分系統(tǒng)、苯丙素的生物合成以及來自鳥氨酸，賴氨酸和煙酸的生物堿生物合成等。

黃獨低溫離體保存微型塊莖差異代謝物的初步發(fā)現(xiàn)為進一步了解黃獨微型塊莖低溫離體保存的分子機制奠定了基礎(chǔ)，也為低溫離體保存黃獨微型塊莖的破除休眠以及其后續(xù)萌發(fā)提供了理論依據(jù)。

1.黃含含,李霞,高文遠,等.薯蕷屬藥用植物的親緣關(guān)系研究[J].中國中藥雜志,2015,40(17):3470-3479.

Huang H H,Li X,Gao W Y,et al.Studies on genetic relationship ofDioscorea[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2015,40(17):3470-3479.

2.劉月學(xué),劉小軍,王家福,等.低溫等因素對枇杷種質(zhì)離體保存的影響[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報,2004,13(1):28-31.

Liu Y X,Liu X J,Wang J F,et al.Effects of low temperature and another condition onEriobotryajaponicagermplasm preservationinvitro[J].Journal of Plant Resources and Environment,2004,13(1):28-31.

3.史永忠,潘瑞熾,王小菁,等.鐵皮石斛種質(zhì)資源的低溫離體保存[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2000,6(4):326-330.

Shi Y Z,Pan R C,Wang X J,et al.Invitroconservation ofDendrobiumofficinaleat low temperature[J].Chinese Journal of Applied and Environmental Biology,2000,6(4):326-330.

4.王運英,張曉麗,白英豪,等.山藥微型塊莖萌發(fā)影響因素研究[J].北方園藝,2015(17):194-196.

Wang Y Y,Zhang X L,Bai Y H,et al.Impact factors in germination of microtubers fromDioscoreaopposita[J].Northern Horticulture,2015(17):194-196.

5.Alizadeh S,Mantell S H,Viana A M.Invitroshoot culture and microtuber induction in the steroid yamDioscoreacompositaHemsl[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1998,53(2):107-112.

6.John J L,Courtney W H,Decoteau D R.The influence of plant growth regulators and light on microtuber induction and formation inDioscoreaalataL.cultures[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1993,34(3):245-252.

7.Li M J,Li J H,Liu W,et al.A protocol forinvitroproduction of microtubers in Chinese yam(Dioscoreaopposita)[J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2014,78(6):1005-1009.

8.Onjo M,Park B J,Hayashi M.Effects of plant growth regulators on plantlet growth and enlargement of microtubers of water yam(DioscoreaalataL.)invitro[J].Japanese Society for Tropical Agriculture,2001,45(2):142-147.

9.Jova M C,Kosky R G,Cullar E E,et al.Efficiency of semi-automated culture systems on microtubers formation of yam(DioscoreaalataL.)[J].Biotechnologie,Agronomie,Société et Environnement,2012,16(1):45-47.

10.Li M J,Li J H,Wang Y P,et al.A simple method for microtuber production inDioscoreaoppositausing single nodal segments[J].Pakistan Journal of Botany,2015,47(2):665-668.

11.Uchendu E E,Sobowale O O,Odimegwu J,et al.Invitrosucrose concentration influences microtuber production and diosgenin content in white yam(DioscorearotundataPoir)[J].InvitroCellular & Developmental Biology-Plant,2016,52(6):563-570.

12.Bazabakana R,Fauconnier M L,Diallo B,et al.Control ofDioscoreaalatamicrotuber dormancy and germination by jasmonic acid[J].Plant Growth Regulation,1999,27(2):113-117.

13.韋本輝,唐榮華,韋威泰,等.淮山零余子不同貯藏方式對出苗及苗期生長影響的研究[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2004,23(1):28-30.

Wei B H,Tang R H,Wei W T,et al.Effects of different store ways on budding rate and seedling growth in yam bulbil[J].Journal of Guangxi Agricand Biol Science,2004,23(1):28-30.

14.Ovono P O,Kevers C,Dommes J.Effects of storage conditions on sprouting of microtubers of yam(Dioscoreacayenensis-D.rotundatacomplex)[J].Comptes Rendus Biologies,2010,333(1):28-34.

15.尹明華,洪森榮,夏瑾華,等.黃獨微型塊莖低溫保存及其萌發(fā)苗遺傳穩(wěn)定性研究[J].廣西植物,2015,35(5):733-740.

Yin M H,Hong S R,Xia J H,et al.Low temperature conservation ofDioscoreabulbiferamicrotuber and genetic stability of its germination seedling[J].Guihaia,2015,35(5):733-740.

16.趙杰才,麻彥,周琴,等.沙米和藜麥種子代謝組比較分析[J].中國食物與營養(yǎng),2016,22(12):64-68.

Zhao J C,Ma Y,Zhou Q,et al.Comparative analysis on metabolomics ofAgriophyllumsquarrosumandChenopodiumquinoaseeds[J].Food and Nutrition in China,2016,22(12):64-68.

17.陳冬梅,李忠,張志興,等.基于GC-MS分析的水稻代謝組學(xué)研究策略[J].中國稻米,2015,21(6):1-6.

Chen D M,Li Z,Zhang Z X,et al.Metabolomics research strategies of rice based on GC-MS[J].China Rice,2015,21(6):1-6.

18.段禮新,漆小泉.基于GC-MS的植物代謝組學(xué)研究[J].生命科學(xué),2015,27(8):971-977.

Duan L X,Qi X Q.GC-MS-based plant metabolomics researches[J].Chinese Bulletin of Life Sciences,2015,27(8):971-977.

19.Cook D,Fowler S,Fiehn O,et al.From the Cover:a prominent role for the CBF cold response pathway in configuring the low-temperature metabolome ofArabidopsis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2004,101(42):15243-15248.

20.Eriksson L,Johansson E,Kettaneh-wold N,et al.Multi and megavariate data analysis.Part Ⅰ.Basic principles and applications:2nd ed[M].Umea,Sweden:Umetrics Academy,2006.

21.淡墨,高先富,謝國祥,等.代謝組學(xué)在植物代謝研究中的應(yīng)用[J].中國中藥雜志,2007,32(22):2337-2341.

Dan M,Gao X F,Xie G X,et al.Application of metabolomics in research of plant metabolites[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2007,32(22):2337-2341.

22.夏濤,高麗萍.類黃酮及茶兒茶素生物合成途徑及其調(diào)控研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(8):2899-2908.

Xia T,Gao L P.Advances in biosynthesis pathways and regulation of flavonoids and catechins[J].Scientia Agricultura Sinica,2009,42(8):2899-2908.

23.彭浩,宋文路,王曉強.水楊酸、脫落酸對鹽脅迫下玉米種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[J].玉米科學(xué),2016,24(6):75-78,87.

Peng H,Song W L,Wang X Q.Effects on seed germination and seedling growth of maize under salt stress with salicy scid and abscisic acid[J].Journal of Maize Sciences,2016,24(6):75-78,87.

24.徐曉昀,郁繼華,頡建明,等.外源水楊酸對低溫脅迫下黃瓜幼苗抗氧化酶活性和基因表達的影響[J].干旱區(qū)地理,2016,39(6):1291-1297.

Xu X Y,Yu J H,Xie J M,et al.Effects of exogenous salicylic acid on antioxidant enzyme activities and gene expression in cucumber seedlings under low temperature stress[J].Arid Land Geography,2016,39(6):1291-1297.

25.張規(guī)富,盧曉鵬,謝深喜.不同時期水分脅迫對椪柑果實檸檬酸代謝相關(guān)基因表達的影響[J].果樹學(xué)報,2015,32(4):525-535.

Zhang G F,Lu X P,Xie S X.Influence of water stress in different development stage on the citric acid metabolism-related genes expression in the Ponkan fruits[J].Journal of Fruit Science,2015,32(4):525-535.

26.肖玉明,盧曉鵬,黃成能,等.水分脅迫對溫州蜜柑果實品質(zhì)及檸檬酸代謝相關(guān)基因表達的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2014,40(3):281-287.

Xiao Y M,Lu X P,Huang C N,et al.Effects of water stress on the fruit quality of citrate and the expression of genes related to metabolism of citric acid[J].Journal of Hunan Agricultural University:Natural Sciences,2014,40(3):281-287.