莫貴友，伍嬌琪，任青媛，賀新生，黃 毅

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

黑輪層炭殼菌（Daldinia concentrica） 為炭角菌科（Xylariaceae） 炭輪菌屬 （Daldinia） 的1種高等真菌，在美洲、歐洲和亞洲等地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)[1]。其主要生活于死亡和腐爛的木頭表面，危害樹木及建筑用木材，特別是生在栽培木耳、香菇、靈芝等經(jīng)濟真菌的椴木上，因而常被視為雜菌[2]。然而近年來，對該菌藥理活性和化學成分的研究發(fā)現(xiàn)，其具有廣泛的藥理學功效，其揮發(fā)油具有抗植物病原真菌作用[3]，香豆素和固醇類成分具有抗癌和抗細菌作用[4]，特別是苯丙呋喃內(nèi)酯類化合物Concentricolide還具有抗艾滋病病毒的作用[5]。這些研究均說明該雜菌可能具有一定的開發(fā)價值。

大量研究試驗發(fā)現(xiàn)，過多的活性氧會損害機體，導致細胞DNA損傷，并可誘發(fā)心臟病、癌癥和衰老等[6]。而抗氧化劑是一類能夠保護機體免受因自由基產(chǎn)生的氧化損傷的重要物質(zhì)。因此，抗氧化劑特別是天然抗氧化劑的發(fā)現(xiàn)近年來獲得科學和工業(yè)界愈來愈多的關注[7]。課題組在對天然大型真菌抗氧化劑的初步篩選系列工作中發(fā)現(xiàn)黑輪層炭殼菌有較強的抗氧化活性，由于氧化壓力與諸多疾病的成因有關，為了該菌生物活性評價的開發(fā)以及抗氧化活性物質(zhì)后續(xù)分離工作的開展，本試驗采用正交試驗對黑輪層炭殼菌抗氧化活性成分的提取工藝進行優(yōu)化，為后續(xù)分離工作的開展和該菌的應用開發(fā)提供一定的理論基礎。

1　材料與方法

1.1　供試菌株

黑輪層炭殼菌子實體，見圖1。于2016年采自四川省綿陽市北川縣，經(jīng)本文作者之一，菌物學教授賀新生鑒定為炭角菌科，炭輪菌屬的黑輪層炭殼菌，拉丁名Daldinia concentrica(Bolton)Ces.&De Not.,Comm.Soc.crittog.Ital.1(4):197(1863)?，F(xiàn)菌種憑證標本保存于西南科技大學微生物實驗室。真菌子實體用純水清除外部雜質(zhì)，室外風干后于50℃烘干至恒重。干燥的子實體粉碎過50目篩，避光干燥保存?zhèn)溆?。整個提取工藝優(yōu)化試驗在1個月內(nèi)完成。

圖1　樹干上的野生子囊果和子囊果橫切面Fig.1　Wild ascocarp on the trunk and cross-section of the ascocarp

1.2　試劑

DPPH（1，1-二苯-2-苦肼自由基） 購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，無水乙醇購自成都市科龍化工試劑廠，以上試劑均為分析純。純水為實驗室自制（電阻率為18 MΩ·cm）。

1.3　設備

可見光分光光度計，7200型，龍尼柯（上海）儀器有限公司；小型中藥材粉碎機，上海淀久中藥機械廠；渦旋混合器，XH-C型，金壇市天竟實驗儀器廠；小型離心機，D1008E型，美國Scilogex有限公司；數(shù)控超聲波清洗器，KQ-200KDE型，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平，BSA124S型，德國賽多利斯有限公司。

1.4　試驗方法

1.4.1樣品提取

本試驗采用超聲輔助提取方法（超聲功率恒定為200W），基本方案為準確稱取500 mg的黑輪層炭殼菌粉末于具塞錐形瓶中，加入10 mL無水乙醇，封口并記錄瓶重，超聲提取10min后，按記錄重量補充原溶劑后，將提取液于10000 r·min-1離心1 min，取上清液用于DPPH抗氧化活性檢測，每個樣品平行制樣3組。

1.4.2DPPH抗氧化活性檢測

提取物抗氧化活性通過DPPH自由基清除率進行判定，采用文獻 [8]的方法略作修改。準確移取200μL樣品溶液與4 mL DPPH溶液（30 mg·mL-1，由無水乙醇配制，該溶液517 nm處吸光度值在0.8附近）置于試管中，渦旋混勻后避光5min，10000 r·min-1離心1 min，取上清轉(zhuǎn)入比色皿，室溫下測定517 nm處吸收值。該值伴隨自由基清除劑量的增多而減弱[9]，樣品抗氧化能力可用清除率（scavenging rate，簡寫為SR，%）來表示，計算公式如下：

式中：Ai為0.2 mL測試溶液與4 mL DPPH溶液混合后的吸光度值；Aj為0.2 mL測試溶液與4 mL無水乙醇溶劑混合后的吸光度值；A0：0.2 mL制備測試溶液時所用溶劑與4 mLDPPH溶液混合后的吸光度值。

1.4.3單因素試驗

影響提取效果的因素主要包括乙醇濃度、浸提溫度、提取時間和固液比，通過初步考察發(fā)現(xiàn)浸提溫度對提取物抗氧化活性影響不大，因此選取剩余3因素進行單因素試驗。在固定其他因素水平情況下，分別考察了提取液醇水比（即乙醇濃度，100%、60%、50%、40%和0），浸提時間（5min、30 min、60 min、90 min和120 min） 和固液比3:100（即30 mg·mL-1）、9:100（即90 mg·mL-1）、3:20（即150 mg·mL-1）和3:10（即300mg·mL-1）。為保證固液比測定的準確性，不同固液比提取的最終溶液均稀釋到相同濃度進行抗氧化活性測試比較。以上所有試驗均同時制備3組。

1.4.4正交試驗

在單因素試驗結(jié)果基礎上，在各因素試驗的自由基清除率極大值附近選取4個水平，以DPPH自由基清除率為指標，設計三因素四水平正交水平表L16（43）進行正交試驗（見表1），優(yōu)化黑輪層炭殼菌中抗氧化活性成分的提取工藝。

表1 L16（43）正交試驗因素與水平設計Tab.1　Factors and levels in the L16(43)orthogonal test

2　試驗結(jié)果

2.1　單因素試驗

2.1.1乙醇濃度對抗氧化活性的影響

溶劑中乙醇濃度對抗氧化活性的影響情況，見圖2。

圖2　溶劑中乙醇濃度對抗氧化活性的影響Fig.2　Effectof ethanol concentrations on the antioxidative activity

從圖2可以看出，無水乙醇和純水均不能最大化提取黑輪層炭殼菌中的抗氧化活性物質(zhì)，伴隨著乙醇濃度的升高，DPPH自由基清除率逐步增大，在60%時該值基本達到最大值，所獲提取液抗氧化活性最強。

2.1.2提取時間對抗氧化活性的影響

提取時間對抗氧化活性的影響情況見圖3。

圖3　提取時間對抗氧化活性的影響Fig.3　Effectof extraction time on the antioxidative activity

從圖3可以看出，伴隨著提取時間的延長（5 min～90 min），DPPH清除率逐漸增大，90 min后DPPH清除率隨時間的延長增大不明顯且有所減少。該結(jié)果說明提取時間對抗氧化活性成分的浸出有較大幫助，但過長的時間并不能帶來提取效果的繼續(xù)增加且對工業(yè)生產(chǎn)成本不利。

2.1.3固液比對抗氧化活性的影響

固液比對抗氧化活性物質(zhì)提取的影響情況，見圖4。

圖4　固液比對抗氧化活性物質(zhì)提取的影響Fig.4　Effectof solid-liquid ratio on the antioxidative activity

從圖4可以看出，固液比在3:100（30mg·mL-1）～9:100（90 mg·mL-1）時，DPPH自由基的清除率隨著固液比的增大逐漸增大。當固液比超過9:100（90 mg·mL-1）時，清除率反而隨之下降，說明固液比過分增大時，不易從黑輪層炭殼菌中提取抗氧化活性成分。結(jié)合圖4顯示固液比在9:100（90 mg·mL-1）時，DPPH自由基清除率最大。

2.2　正交試驗

正交試驗結(jié)果和分析見表2和表3。

極差R值分析表明，3種因素的主次關系是RB>RC>RA，即乙醇濃度（B） ＞固液比（C） ＞提取時間（A）。因此最佳組合為A1B1C1，即浸泡超聲提取時間30 min，乙醇濃度100%，固液比為3:100（即30 mg·mL-1）。按照正交試驗所確定的最佳提取條件進行驗證性試驗，計算得到黑輪層炭殼菌抗氧化活性物質(zhì)DPPH自由基清除率為76.87%，對比自由基清除率最大值為60.38%，證明正交試驗結(jié)果對黑輪層炭殼菌抗氧化活性成分提取的優(yōu)化作用明顯。

表2　正交試驗結(jié)果Tab.2　Results of the orthogonal test

表3　正交試驗結(jié)果分析Tab.3　Data analysis of the orthogonal test

3　結(jié)論

全球范圍內(nèi)真菌資源豐富[10]，是活性天然產(chǎn)物開發(fā)的巨大源泉。由于抗氧化活性和很多疾病治療的聯(lián)動效應，真菌資源中的抗氧化活性化合物的發(fā)現(xiàn)更應該成為科學和工業(yè)界關注的熱點。

在真菌中，常見的抗氧化活性成分主要有多酚類、三聯(lián)苯類、聚酮類、生物堿、萜類、甾體和多糖類[11]。目前，黑輪層炭殼菌中已發(fā)現(xiàn)的化學成分包括倍半萜烯、角鯊烯型三萜類化合物和麥角甾醇等[12-15]，但并沒有關于這些化學成分的抗氧化活性報道。唯一報道具有自由基清除作用的是Lee于2015年從該菌中分離出來的異吲哚啉酮衍生物 Daldinan A[16]。因此，該菌中抗氧化活性成分的物質(zhì)基礎是哪個或哪類化合物實際還并不清晰。

本文通過單因素試驗和L16（43）正交試驗，得到了從黑輪層炭殼菌中獲得抗氧化活性成分的最佳提取條件：提取時間30min，乙醇濃度100%，固液比3:100（即30 mg·mL-1）。其中乙醇濃度對抗氧化活性物質(zhì)的提取影響最大。以上的試驗結(jié)果，為該菌抗氧化活性成分未來分離工藝摸索和該菌作為食（藥）用保健品的開發(fā)打下良好基礎。

參考文獻：

[1]Singh J.Buildingmycology:management of decay and health in buildings[M].London:Taylor and Francis,1994.

[2]賀新生.四川盆地蕈菌圖志[M].北京：科學出版社，2011：12-13.

[3]羅都強，唐宏亮，楊小龍，等.從子囊菌炭球菌中分離的活性成分L-696,474和Cytochalasin D對植物病原真菌的活性[J].植物保護學報，2007，32（2）：113-122.

[4]Liarzi O,Bar E,Lewinsohn E,et al.Use of the endophytic fungusDaldinia cf.concentricaand its volatiles as bio-control agents[J].Plos One,2016,11(12):0168242.

[5]Qin XD,Dong ZJ,Liu JK,et al.Concentricolide,an anti-HIV agent from the ascomyceteDaldinia concentrica[J].Helvetica Chimica Acta,2006,89(1):127-133.

[6]樊岫珊.羥基自由基誘導DNA損傷機理研究進展[J].生物學雜志，2017，195（1）：80-84.

[7]Mukthapura A,Shimogga A,Vinodchandran K,et al.Oxidative products of proteins and antioxidant potential of thiols in gastric carcinoma patients[J].Journal of Medical Biochemistry,2010,29(2):102-106.

[8]Pyrzynska K,PekalA.Application of free radicaldiphenylpicrylhydrazyl(DPPH)to estimate the antioxidant capacity of food samples[J].AnalyticalMethods,2013,5(17):4288-4295.

[9]李鉉軍，崔勝云.抗壞血酸清除DPPH自由基的作用機理[J].食品科學，2011，398（1）：86-90.

[10]Boa E.Ainsworth and bisby’s dictionary of the fungi[J].Plant Pathology,2002,47(4):541.

[11]李峻志，吳小杰，黨永，等.大型真菌抗氧化活性物質(zhì)的研究進展[J].食品與生物技術(shù)學報，2014，170（5）：455-465.

[12]常麗影，周賢，李愛欣，等.藥用真菌炭球菌生藥學研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，117（17）：21-23.

[13]Qin XD,Shao HJ,Dong ZJ,et al.Six new induced sesquiterpenes from the cultures of ascomyceteDaldinia concentrica[J].Journal of Antibiotics,2008,61(9):556-562.

[14]Stadler M,Baumgartner M,Grothe T,et al.Concentricol,a taxonomically significant triterpenoid fromDaldinia concentrica[J].Phytochemistry,2001,56(8):787-793.

[15]Ngoc QD,Toshihiro H,Masami T,et al.Concentriols B,C and D,three squalene-type triterpenoids from the ascomyceteDaldinia concentrica[J].Phytochemistry,2002,61(3):345-353.

[16]Lee IK,Kim SE,Yeom JH,et al.Daldinan A,a novel isoindolinone antioxidant from the ascomyceteDaldinia concentrica[J].Journal of Antibiotics,2012,65(2):95-97.