張志英，肖斌，蔣娟，黃秀娜，張蓉，李曉，劉娟子，連菲，楊永泉，張瑩瑩，孫朝暉，李林海

中國人民解放軍廣州總醫(yī)院，廣東 廣州 510010

B細胞連接蛋白（B-cell linker，BLNK；或稱SLP-65、BASH或BCA）是一種接頭蛋白，主要表達于B細胞和巨噬細胞中，能夠向其下游的分子傳遞磷酸化信號，進而參與B細胞受體（B cell receptor，BCR）的信號轉(zhuǎn)導過程[1]。1998年日本學者發(fā)現(xiàn)并定義了人體內(nèi)的BLNK蛋白[2]。

當BCR發(fā)生偶聯(lián)后，ITAM基序與脾酪氨酸激酶（Syk）結(jié)合使Syk發(fā)生酪氨酸磷酸化，磷酸化的Syk與BLNK結(jié)合使BLNK發(fā)生酪氨酸磷酸化，磷酸化的BLNK可以招募下游的多個效應蛋白，包括Grb2、Sos、PLCγ和Nck，進而PLC-γ2、Ras和Rac1-JNK信號通路得到活化[3-5]。BLNK在整個B細胞的發(fā)育過程中發(fā)揮巨大作用，在一些癌癥尤其是前體B細胞白血病的治愈過程中的作用更明顯[6]。在此，我們構(gòu)建了pMAL-c5x-BLNK重組質(zhì)粒并表達純化了BLNK蛋白，為后續(xù)探討B(tài)LNK蛋白的相互作用蛋白和分子結(jié)構(gòu)打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21（Plyss）（本實驗室保種）、TOP10感受態(tài)細胞［天根生化（北京）有限公司］；pMAL-c5x質(zhì)粒（鐘鼎生物公司）；質(zhì)粒小抽試劑盒（Biotool公司）；蛋白marker（Thermo公司）；IPTG、Acr、Bis、Tris（Sigma公司）；SDS（Amresco公司）；TEMED（Bio-Rad公司）；限制性內(nèi)切酶（Ta?KaRa公司）；PfuDNA聚合酶（Zoonbio公司）；胰蛋白胨、酵母抽提物（Oxoid公司）；瓊脂糖（上?；蚬荆籇NA膠純化試劑盒（Axygen公司）。

1.2 基因擴增和pMAL-c5x-BLNK質(zhì)粒構(gòu)建

提取293T細胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR擴增獲取BLNK全長基因。PCR反應體系：模板DNA 2.0 μL，引物F 11.0 μL，引物R 11.0 μL，10×緩沖液5.0 μL，dNTP混合液4.0 μL，PfuDNA聚合酶1.0 μL，蒸餾水加至50 μL。擴增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。擴增完畢，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，割膠純化特異性的單一擴增條帶。將純化的目的基因和原核表達質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，并用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10克隆菌株，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切篩選陽性克隆，送華大基因公司測序，驗證無誤后用于后續(xù)實驗。將重組質(zhì)粒命名為pMAL-c5x-BLNK（圖1）。

圖1 pMAL-c5x質(zhì)粒模式圖

1.3 誘導表達和鑒定

將1 μL重組質(zhì)粒pMAL-c5x-BLNK加入100 μL感受態(tài)大腸桿菌BL21（Plyss）中，置冰上20 min；42℃熱激90 s，迅速置冰中5 min；加入600 μL LB培養(yǎng)液，37℃、220 r/min振搖1 h；離心后全部涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

IPTG誘導BLNK融合蛋白的表達。挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種于含50 μg/mL氨芐青霉素的3 mL LB培養(yǎng)液試管中，37℃、220 r/min振搖過夜；次日按1∶100接種于含50 μg/mL氨芐青霉素的30 mL LB培養(yǎng)液中，37℃、220 r/min振搖至菌液D600nm為0.6～0.8（約2 h）；取1 mL培養(yǎng)物，室溫下10 000 r/min離心2 min，棄上清，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀。向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，11℃、220 r/min振搖過夜，誘導融合蛋白表達；取出1 mL培養(yǎng)物，室溫下10 000 r/min離心2 min，棄上清，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀。剩余培養(yǎng)物4000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS重懸菌體沉淀；重懸液經(jīng)超聲波破碎后，分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸，進行12%SDSPAGE，考馬斯亮藍染色顯帶。

1.4 融合蛋白的MBP柱親和純化

利用低壓層析系統(tǒng)，溶液以0.5 mL/min流速上樣至MBP結(jié)合緩沖液預平衡的Amylose親和層析柱；用MBP結(jié)合緩沖液以0.5 mL/min的流速沖洗，至流出液D280nm值到達基線；用MBP洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L麥芽糖，0.15 mol/L NaCl，pH8.0）以1 mL/min的流速洗脫目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，用20 mmol/L Tris-HCl、0.10 mol/L NaCl（pH8.0）透析過夜，進行12%SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果

2.1 BLNK基因擴增和pMAL-c5x-BLNK質(zhì)粒構(gòu)建

提取293T細胞RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖2A）顯示擴增出1條特異性條帶，大小介于1000與1500 bp之間，與理論值1369 bp相符。對該特異性條帶進行割膠純化，純化的目的基因和原核表達質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，涂板、挑單克隆、過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒被AsiSⅠ和MluⅠ雙酶切成線性化載體（大片段）及插入基因（小片段）兩部分（圖2B）。華大基因公司測序證實插入基因序列正確，無突變、缺失，表明pMAL-c5x-BLNK原核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 誘導表達和鑒定

將pMAL-c5x-BLNK重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（Plyss），IPTG濃度為0.5 mmol/L，于11℃、220 r/min振搖過夜，誘導融合蛋白表達。重懸液經(jīng)超聲波破碎后，分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸，進行12%SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍染色顯帶，結(jié)果如圖3，在相對分子質(zhì)量約116×103處有較濃的特征蛋白條帶出現(xiàn)，與預期大小一致，而對照組無此條帶，說明重組菌能表達BLNK蛋白。沉淀液在相應位置沒有條帶，說明BLNK蛋白主要在菌液上清中。

2.3 融合蛋白的MBP柱親和純化

圖2 BLNK基因的擴增（A）及pMAL-c5x-BLNK重組質(zhì)粒的酶切鑒定（B）M：DNA marker；1：陰性對照；2，3：基因擴增產(chǎn)物；4：酶切前；5：酶切后

圖3 重組菌的誘導表達M：蛋白marker；1：未誘導；2：誘導后的菌液；3：誘導后的菌液上清；4：誘導后的菌液沉淀

表達菌株經(jīng)誘導表達后，通過MBP柱親和純化并進行12%SDS-PAGE分析，在相對分子質(zhì)量約116×103處可見蛋白帶（圖4），無雜帶，與目標條帶相符，表明制備了純度較高的BLNK蛋白。

圖4 BLKN蛋白親和純化的SDS-PAGE分析M：蛋白marker；1：未純化；2：流出液；3：洗脫液

3 討論

BLNK是B細胞特異性的連接蛋白，當抗原與BCR結(jié)合后活化下游的Syk，活化的Syk磷酸化BLNK，磷酸化BLNK為眾多免疫調(diào)節(jié)分子提供結(jié)合位點，并與招募的B細胞信號分子結(jié)合，從而調(diào)節(jié)MAP3K、JNK及NF-κB等信號通路，對B細胞的發(fā)育和功能起關(guān)鍵性作用[7-10]。BLNK在整個B細胞的發(fā)育過程發(fā)揮巨大作用，在一些癌癥尤其是前體B細胞白血病的治愈過程中發(fā)揮著巨大的作用。前體B細胞急性淋巴細胞白血病是兒童常見白血病，研究表明50%的患者都是因為體內(nèi)缺少BLNK表達所造成的，因此BLNK在人體中是一種重要的腫瘤抑制因子[11-17]。

我們將pMAL-c5x-BLNK重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（Plyss）后優(yōu)化表達條件，將表達溫度分別調(diào)整至11、15、18、25、37℃，目標蛋白均可以表達，但表達效果略有差異。經(jīng)過多次優(yōu)化，最終結(jié)果表明轉(zhuǎn)化BL21（Plyss）后IPTG濃度0.5 mmol/ L、溫度11℃時表達效果最好，條帶清晰無雜帶。

綜上，我們構(gòu)建了B細胞連接蛋白的原核表達質(zhì)粒pMAL-c5x-BLNK，并獲得了高純度的B細胞連接蛋白，為后續(xù)研究BLNK蛋白的相互作用蛋白和分子結(jié)構(gòu)打下了基礎(chǔ)。

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