邱語進(jìn)，孫志杰，趙鵬，付楚溪，霍江，熊向華，汪建華，萬冬梅，張惟材

1.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071；3.沈陽藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；4.沈陽師范大學(xué)，遼寧 沈陽 110034；5.解放軍第307醫(yī)院 麻醉科，北京 100071

肉毒毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）是一類由厭氧肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridium botuli?num）產(chǎn)生的神經(jīng)毒素，是迄今已知毒性最強(qiáng)的蛋白毒素[1-3]。肉毒毒素共有7種血清型（A～G），其中A型最為常見，近年來已應(yīng)用于美容和治療偏頭痛、眼能動(dòng)性、運(yùn)動(dòng)障礙等疾病[4-5]。A型肉毒毒素由一條重鏈和一條輕鏈通過二硫鍵連接構(gòu)成，重鏈的N端為跨膜區(qū)、C端為受體結(jié)合區(qū)，輕鏈為依賴Zn2+的內(nèi)肽酶。A型肉毒毒素（BoNT/A）在神經(jīng)肌肉接頭處與神經(jīng)細(xì)胞表面的受體結(jié)合，借助重鏈N端跨膜將輕鏈送至胞內(nèi)，通過切割突觸囊泡相關(guān)蛋白SNAP25從而阻斷神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，引發(fā)肌肉持續(xù)的松弛性麻痹[6-7]。

突觸囊泡蛋白2（synaptic vesicle protein 2，SV2）是一類在內(nèi)分泌泡及突觸囊泡廣泛表達(dá)的跨膜糖蛋白，包含12次跨膜的疏水結(jié)構(gòu)域（trans?membrane regions，TMR），具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、內(nèi)分泌泡胞吐作用、維持突觸囊泡穩(wěn)態(tài)及參與神經(jīng)肌肉接頭形成等生物學(xué)功能。Dong等研究發(fā)現(xiàn)SV2的3個(gè)亞型SV2A、SV2B、SV2C均可作為BoNT/A的受體，其中SV2C與BoNT/A的親和力最高[8]，其TMR7、TMR8之間的突觸泡大突環(huán)L4上的529～566位氨基酸與BoNT/A結(jié)合[7,9-10]。本研究中我們表達(dá)純化了SV2C/L4蛋白，免疫小鼠后經(jīng)2輪篩選得到13株單抗，其中30號(hào)抗體與SV2C的親和力最高，且具有一定的中和活性。

1 材料與方法

1.1 材料

昆明小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）購自北京天根生化科技有限公司；pGEX-KG-SV2C/L4質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建；脫脂奶粉購自生工生物工程股份有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、TMB顯色液購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；Western印跡試劑盒、Proteinlso GST Resin購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；抗體亞類鑒定試劑盒購自北京博奧龍免疫有限公司；酶標(biāo)板、細(xì)胞培養(yǎng)板購自康寧公司；PVDF膜購自Merk Millipore公司；HiTraP Protein G HP購自GE Healthcare公司。

1.2 制備抗原SV2C

將構(gòu)建的pGEX-KG-SV2C/L4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取陽性克隆接種于200 mL含氨芐青霉素（Amp）的LB培養(yǎng)基中，于37℃、220 r/min培養(yǎng)至D600nm為0.5～0.8，加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG于20℃誘導(dǎo)18 h，4℃、12 000 r/ min離心收集菌體，加20 mL裂解液重懸，置于冰上超聲波裂解菌體，4℃、12 000 r/min離心收集上清，按1∶2000的比例加入GST瓊脂糖珠，4℃結(jié)合2 h，先用洗滌緩沖液漂洗4次，后用洗脫緩沖液洗脫并收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.3 雜交瘤細(xì)胞篩選

采用4只SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠，每只小鼠初次免疫經(jīng)皮下多點(diǎn)注射60 μg SV2C/L4蛋白，加強(qiáng)免疫3次后測定小鼠血清效價(jià)，選擇效價(jià)最高的小鼠提高免疫用量進(jìn)行腹腔沖擊，培養(yǎng)10 d后分離小鼠脾細(xì)胞，采用PEG法與生長對(duì)數(shù)期的Sp2/0細(xì)胞融合，用半固體培養(yǎng)基（含HAT）篩選培養(yǎng)14～21 d，間接ELISA篩選陽性克隆。動(dòng)物免疫與雜交瘤細(xì)胞初篩交由北京華大蛋白研發(fā)中心有限公司完成。

1.4 抗體效價(jià)測定

用5 μg/mL的SV2C抗原37℃孵育2 h，PBST洗滌3次；用5%脫脂牛奶37℃封閉2 h，PBS-T洗滌3次；細(xì)胞上清按1∶200稀釋作為起始濃度，然后按1∶2梯度稀釋共10個(gè)濃度，取100 μL依次加入酶標(biāo)板，37℃孵育1 h，PBS-T洗滌3次；二抗羊抗鼠1∶2000稀釋，37℃孵育1 h，PBS-T洗滌3次；顯色5～10 min，終止反應(yīng)后讀數(shù)。

1.5 抗體亞型鑒定

取細(xì)胞培養(yǎng)上清，按試劑盒說明書鑒定抗體亞型。

1.6 抗體制備

每只BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟預(yù)處理1周，之后經(jīng)相同途徑注射0.5 mL濃度為2×106/mL的細(xì)胞懸液，7～10 d見小鼠腹部明顯膨大即可剖腹收集腹水，離心收集上清。用結(jié)合緩沖液稀釋小鼠腹水，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，Protein G親和柱上樣，平衡至基線平穩(wěn)，加入洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰，SDSPAGE鑒定后分裝于-20℃保存。

1.7 抗體結(jié)合表位類型鑒定

取20 μL純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，PBS-T洗膜，待測抗體按1∶1000的比例稀釋，室溫孵育1 h，PBS-T洗膜，二抗羊抗鼠按1∶2000的比例稀釋，室溫孵育1 h，PBS-T洗膜，顯色。

1.8 抗體親和力常數(shù)測定

將不同濃度（5、2.5、1.25、0.625 μg/mL）的SV2C/L4抗原依次加入酶標(biāo)板中包被，空白孔加入包被緩沖液，37℃孵育2 h；用5%脫脂牛奶37℃封閉2 h，PBS-T洗1次；將不同濃度（288 μg/mL，1/2梯度稀釋16個(gè)濃度）的一抗依次加到包被好的酶標(biāo)板中，37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；羊抗鼠二抗按1∶2000稀釋，37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；避光顯色5～15 min后終止反應(yīng)，雙波長測定吸光度值，記錄數(shù)據(jù)。

以抗體濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)，利用GraphPad Prism 5軟件擬合出不同抗原濃度的EC50，按Beaty[11]推導(dǎo)的公式計(jì)算K值并求平均值，即為親和力常數(shù)。

1.9 抗體中和活性實(shí)驗(yàn)

參照Diamant等的方法[12]進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 抗原SV2C/L4的純化

重組菌pGEX-KG-SV2C/L4/BL21（DE3）誘導(dǎo)表達(dá)后超聲波裂解，取裂解上清用于GST親和層析純化，SDS-PAGE分析顯示得到特異性純化蛋白條帶，與融合蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量相符，Gel-Pro Analyzer軟件分析蛋白純度達(dá)到95%以上（圖1）。

圖1 目的蛋白純化的SDS-PAGE檢測M：蛋白marker；1，2：SV2C/L4純化蛋白

2.2 雜交瘤細(xì)胞篩選和抗體分型

用間接ELISA測定3次加強(qiáng)免疫后的4只小鼠的血清效價(jià)，結(jié)果見表1，1號(hào)小鼠血清效價(jià)最高，選取1號(hào)小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行2輪篩選，獲得13株陽性雜交瘤細(xì)胞，間接ELISA測定這13株細(xì)胞上清效價(jià)為6.4×103～1.024×105（表2），其中30號(hào)細(xì)胞上清的效價(jià)最高為1.024×105。測得抗體的重鏈大部分為IgG1、IgG2a型，輕鏈均為κ型（表2）。

圖2 SV2C抗體純化的SDS-PAGE檢測M：蛋白marker；1：SV2C抗體

2.3 抗體純化

小鼠腹水經(jīng)Protein G柱親和層析純化，SDSPAGE分析抗體純度大于95%（圖2）。

2.4 抗體結(jié)合表位類型鑒定

Western印跡顯示并無明顯條帶，而ELISA結(jié)果表明鼠單抗可以與抗原SV2C/L4反應(yīng)，由此推測該抗體結(jié)合表位類型是空間表位。

表1 小鼠血清效價(jià)

表2 13株抗體效價(jià)及亞型

2.5 抗體親和力常數(shù)測定

間接ELISA測定30號(hào)單抗與SV2C/L4抗原的親和力常數(shù)，結(jié)合反應(yīng)曲線如圖3。用GraphPad Prism 5分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，抗原濃度為5、2.5、1.25、0.625 μg/mL時(shí)所對(duì)應(yīng)的EC50分別為0.570、1.083、2.334和2.203 ng/mL。代入公式K=2（nAbx-Aby）/（n-1）（n=x/y，x＞y），計(jì)算所得K值的平均值即為親和力常數(shù)。最終計(jì)算得到30號(hào)單抗與SV2C/L4抗原的親和力常數(shù)K=6.7 nmol/L。

2.6 抗體的中和活性

中和活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針對(duì)BoNT/A的30號(hào)抗體中和活性為100 LD50/mg。

圖3 抗體SV2C與抗原親和力常數(shù)

3 討論

傳統(tǒng)理論認(rèn)為BoNT/A在神經(jīng)細(xì)胞表面有神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b和SV2等2種受體[13-16]。GT1b是一種酸性鞘糖脂，在神經(jīng)細(xì)胞表面數(shù)量較豐富，在細(xì)胞分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮重要作用[18]；SV2位于脊椎動(dòng)物的突觸泡與內(nèi)分泌泡上，與神經(jīng)肌肉接頭形成、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放相關(guān)。當(dāng)BoNT/A進(jìn)入神經(jīng)肌肉接頭后，首先與神經(jīng)細(xì)胞表面的GT1b結(jié)合并完成對(duì)毒素的富集[17]；富集的毒素再與神經(jīng)細(xì)胞表面的蛋白受體SV2結(jié)合，并在SV2的介導(dǎo)下完成內(nèi)吞[16]。但是，2013年Jacky等研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子受體3（fi?broblast growth factor receptor 3，F(xiàn)GFR3）是BoNT/ A的一種新受體[18]，其與毒素結(jié)合后會(huì)引發(fā)毒素內(nèi)吞。目前BoNT/A的3種受體特別是2種蛋白受體（SV2/FGFR3）的相互關(guān)系還不明確，我們希望制備2種蛋白受體的抗體來研究它們之間的相互關(guān)系。本研究中我們通過免疫小鼠篩選陽性雜交瘤細(xì)胞來制備SV2C特異性抗體，經(jīng)4次皮下注射和1次腹腔注射免疫BALB/c小鼠，選取血清效價(jià)最高的小鼠完成雜交瘤細(xì)胞制備，采用間接ELISA法進(jìn)行2輪篩選，最終得到了13株抗體。選取效價(jià)最高的30號(hào)抗體制備純化腹水，純化抗體與SV2C抗原的親和力常數(shù)為6.7 nmol/L，對(duì)BoNT/A的中和活性為100 LD50。我們得到1株高純度、高親和力并對(duì)BoNT/A具有一定中和活性的抗SV2C鼠單抗，為我們研究BoNT/A受體的相互關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

目前，針對(duì)BoNT/A中毒的治療尚無有效的化學(xué)藥物，而臨床使用的馬多抗存在過敏反應(yīng)等安全隱患，基因工程單抗是發(fā)展的主流方向。Nowakowski等獲得的S25、C25、3D12[19]和XOMA公司研發(fā)的NX01、NX02、NX11[20]單抗均具有很好的中和活性，但這些單抗都是針對(duì)BoNT/A的受體結(jié)合區(qū)。本研究篩選得到針對(duì)BoNT/A的SV2C受體的具有一定的中和活性的單抗，這一結(jié)果提示可以通過直接封閉BoNT/A的受體來達(dá)到治療目的，為肉毒中毒治療提供了新的途徑。

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