黃驛勝，王競(jìng)楓，林 楓，葉啟文，李林立，張代場(chǎng)

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一。目前，我國HCC患者約占全球的 55%，已成為發(fā)病率最高的國家［1，2］。 肝癌的發(fā)生與遺傳、環(huán)境等多種因素相關(guān)，如肝炎病毒感染、黃曲霉素的攝入、寄生蟲感染、氯仿等。其中，大多數(shù)肝癌的發(fā)生都是由肝炎病毒（HBV、HCV）的感染造成的［3］。HCC發(fā)病機(jī)制隱匿，早期診斷困難，進(jìn)展期快，惡性度高，術(shù)后高復(fù)發(fā)，預(yù)后性差給社會(huì)和醫(yī)療體系造成了巨大的負(fù)擔(dān)。不少患者在就診時(shí)腫瘤已經(jīng)發(fā)展到了中晚期，失去了最佳治療機(jī)會(huì)，即使是接受了手術(shù)，預(yù)后依然很差，5年總體生存期仍不理想［4］。因此，如何更加有效地防治HCC成為進(jìn)一步提高患者生存率的主要問題。

氨基?；?1（ACY-1）是一種含鋅金屬酶，廣泛分布于各種組織，基因定位于3p21［5］。ACY-1主要參與生物體內(nèi)氨基酸代謝，專一水解N-?；?L-氨基酸的酰胺鍵形成L-氨基酸，而L-氨基酸參與機(jī)體代謝過程，具有生理活性［6-8］。遺傳性ACY-1表達(dá)缺失會(huì)造成代謝異常，致使神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)為尿液中N-乙酸氨基酸的檢出增加。ACY-1在不同腫瘤組織中的表達(dá)趨勢(shì)也有所不同。在腎癌、肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中ACY-1表達(dá)下調(diào)，結(jié)直腸癌組織中ACY-1表達(dá)上調(diào)，而ACY-1在結(jié)直腸癌組織中的高表達(dá)預(yù)示結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良。此外，Mitta和Tsunasawa等通過對(duì)大腸癌細(xì)胞、小鼠黑色素瘤細(xì)胞中ACY-1的表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ACY-1在抑癌方面有著重要的作用［9］。由此推測(cè)ACY-1可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，或許是潛在的肝癌預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物。

為探討ACY-1在肝癌中的表達(dá)及其作用，筆者收集手術(shù)切除的新鮮肝癌組織及配對(duì)癌旁組織，利用qRT-PCR技術(shù)和免疫印跡的方法分別對(duì)HCC患者的癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的ACY-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。另外，同時(shí)結(jié)合免疫組化的方法，分析了手術(shù)切除、病理科存檔的HCC患者石蠟標(biāo)本中ACY-1蛋白的表達(dá)水平及其與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，以期為肝癌的診斷、治療提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料 HCC患者86例，為寧德市閩東醫(yī)院肝膽外科2009年—2014年手術(shù)切除、病理科存檔石蠟標(biāo)本，所有患者在手術(shù)前均未接受化療和放療。其中男56例，女30例；年齡35~74歲，中位年齡50歲。根據(jù)Edmondso四級(jí)分級(jí)法，將HCC分為Ⅰ~Ⅳ級(jí)，Ⅰ、Ⅱ級(jí)為高分化，Ⅲ、Ⅳ級(jí)為低分化。其中，高分化56例，低分化30例；腫瘤直徑＜5 cm 48例，直徑≥5 cm 38 例；AFP （ng/ml）≥20 ng/ml 58例，AFP（ng/ml）<20 ng/ml 28例；配對(duì)的癌旁組織86例，取距腫瘤病灶邊緣至少2 cm以外肝組織。

另收集寧德市閩東醫(yī)院肝膽外科2014年—2015年手術(shù)切除的新鮮肝癌組織標(biāo)本30例。HCC患者術(shù)前未接受其他治療措施，HCC組織標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診為原發(fā)性HCC，配對(duì)的癌旁組織取至距腫瘤邊緣至少2 cm以外肝組織。組織標(biāo)本離體后立刻存儲(chǔ)于液氮，并記錄患者臨床信息，如年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)、AFP水平等。樣品采集遵循法律和倫理委員會(huì)準(zhǔn)則，并取得患者知情同意。

1.2主要儀器與試劑 高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國）；PCR 儀（Eppendorf，德國）；Bio-Rad 電泳系統(tǒng) （Bio-Rad，美國）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）；熒光定量 PCR 儀（Roche 480）；Trizol（Invitrogen，美國）；RNase-free 水（Takara，中國大連）；2×Taq PCR MasterMix（全式金，北京）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara，中國大連）；SYBR○RPremix Ex TaqTMII （Tli RNase HPlus），Bulk（Takara，中國大連）；BCA 定量試劑盒（凱基生物，南京）；ACY-1 抗體（abcam，美國）；抗β-actin 單克隆抗體（Sigma，美國）。

1.3方 法

1.3.1引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物序列并由上海生工生物工程公司合成。具體引物序列如下：β-actin上游引物 5'-TTGTTACAGGAAGTC CCTTGCC-3'，β-actin 下游引物 5'-ATGCTATCAC CTCCCCTGTGTG-3'；ACY-1上游引物 5'-GGCTG CATGAGGCTGTGTT-3'，ACY-1下游引物 5'-CTT GGCACTGGTTGGGATG-3'。

1.3.2RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 取標(biāo)本50 mg，加入液氮研磨成粉末，Trizol裂解后繼續(xù)不斷研磨至液體。經(jīng)氯仿分層、異丙醇沉淀及75%乙醇溶液洗滌干燥后，用適量DEPC水溶解RNA沉淀。取1 μl溶液用NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度及純度，然后進(jìn)行cDNA的合成和RNA的電泳。按照TaKaRa試劑盒的操作步驟去基因組DNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，模板RNA 1 μl加入反應(yīng)體系后，37 ℃孵育 15 min，85℃孵育5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用SYBR○RGreen qPCR進(jìn)行檢測(cè)，β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)體系為：20 μl：Ex Taq（2×）10 μl，PCR Forward Primer （10 μM）0.8 μl，PCR Reverse Primer（10 μM）0.8 μl，DNA 模板 2 μl，ddH2O 6.4 μl。反應(yīng)設(shè)三復(fù)孔。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 sec；PCR 95℃ 5 sec，60℃ 30 sec，45 個(gè)循環(huán)；融解 95℃5 sec，60 ℃ 1 sec；降溫 50 ℃ 30 sec。 利用 2-△△Ct法計(jì)算分析ACY-1mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4蛋白提取 取大約300 mg樣本，研磨后，按1∶5（V/W）的比例加入含有1×蛋白水解酶抑制藥的TBS （Tris HCl 50 mmol/L pH7.4；EDTA 2 mmol/L；NaCl 150 mmol/L），將勻漿液超聲破碎處理3 min。然后，加入等體積含1×蛋白酶抑制藥的0.2%十二烷基硫酸鈉溶液（SDS），4℃12 000 rpm離心1 h，收集上清并分裝后于-80℃保存。

1.3.5蛋白濃度測(cè)定 利用BCA Protein Assay Kit進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，配置工作液，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品至不同濃度梯度，同時(shí)稀釋ACY-1蛋白樣本10倍待用。將樣品及標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔板后加入工作液，65℃孵育30 min后，酶標(biāo)儀測(cè)定A562 nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。

1.3.6Western blot分析 灌制分離膠和濃縮膠，加電泳緩沖液后上樣，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印于NC膜。3%脫脂奶粉封閉后加入一抗：ACY-1抗體（1∶5000）和 β-actin 抗體（1∶5000）；4 ℃過夜后洗膜，加入二抗37℃孵育1 h。洗膜后加入ECL顯影，用凝膠圖像分析儀掃描照片。最后用image-plus軟件測(cè)量灰度值做統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.7免疫組化分析 肝組織標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋后制片；免疫組織化學(xué)以SP法進(jìn)行。DAB顯色，蘇木素復(fù)染后封片。在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，當(dāng)胞質(zhì)棕黃色染色強(qiáng)度高于背景非特異染色時(shí)判斷為陽性染色細(xì)胞。

1.3.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以（x±s）表示。采用方差分析比較各組之間的差異顯著性，并進(jìn)行等級(jí)相關(guān)分析，p＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ACY-1 mRNA和ACY-1蛋白在HCC組織中的表達(dá) 利用qRT－PCR檢測(cè)30對(duì)肝癌組織及配對(duì)癌旁組織中ACY－1 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：肝癌組織中ACY－1 mRNA的表達(dá)水平明顯低于配對(duì)癌旁組織 （圖1）。同時(shí)，又利用Western blot方法檢測(cè)了8對(duì)肝癌組織及配對(duì)癌旁組織中ACY－1的表達(dá)水平，并采用Image J圖像分析軟件掃描測(cè)定光密度值，而后與內(nèi)參β－actin光密度值相比，得出相對(duì)值（圖2）。結(jié)果表明：肝癌組織中ACY－1蛋白表達(dá)水平也明顯低于配對(duì)癌旁組織。

圖1　HCC組織及配對(duì)癌旁組織中ACY-l mRNA的表達(dá)

圖2　Western Blot檢測(cè)ACY-l蛋白在HCC組織及配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)

2.2免疫組化分析HCC組織中ACY-1的表達(dá)利用免疫組化方法檢測(cè)86對(duì)HCC組織及其配對(duì)癌旁組織中ACY－1蛋白的表達(dá)。ACY－1蛋白陽性表達(dá)為黃色或棕黃色顆粒，根據(jù)陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度計(jì)分，將肝癌組織分為ACY－1高表達(dá)組（評(píng)分“強(qiáng)”）和低表達(dá)組（評(píng)分“弱”或“中”）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HCC組織中ACY－1表達(dá)陽性率低于癌旁組織且具有顯著差異，這與Western Blot結(jié)果一致（圖3）。另外，分析ACY－1蛋白表達(dá)水平與HCC患者的臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，ACY－1蛋白表達(dá)水平與AFP水平密切相關(guān)，但與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織分化程度、HBV感染因素?zé)o關(guān)（表1）。

圖3　免疫組化檢測(cè)ACY-1蛋白在HCC組織和癌旁組織中表達(dá)

表1　ACY-1蛋白表達(dá)與HCC臨床病理特征關(guān)系

3　討論

肝細(xì)胞癌（HCC）是一種常見的惡性腫瘤，死亡率位居世界惡性腫瘤的前三位，其發(fā)病率高，惡性程度高，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，預(yù)后差。我國是肝癌的高發(fā)國家，HCC死亡人數(shù)約占世界的1/2以上，究其原因之一是患者未能盡早發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療，不同分期的HCC療效和預(yù)后有很大的差異。成人肝細(xì)胞受損時(shí)，肝干細(xì)胞可分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，而干細(xì)胞的子代有合成AFP的能力，也有發(fā)展為腫瘤細(xì)胞的可能性，故AFP廣泛應(yīng)用于HCC的普查和診斷，是一種特異的篩查和診斷HCC的腫瘤標(biāo)志物，它與影像學(xué)檢查相結(jié)合可以早期發(fā)現(xiàn) HCC。正常人血清AFP參考值為0～7 ng/ml，臨床上一般以20 ng/ml作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

一部分肝炎或肝硬化患者AFP輕度升高，但一般不會(huì)超過200 ng/ml［10］。肝硬化是肝癌發(fā)生的主要病因。如以AFP＞20 ng/ml為標(biāo)準(zhǔn)，急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化的AFP陽性率分別為31%～52%、5%～58%和11%～47%。血清AFP為400 ng/ml是HCC的臨界值。當(dāng)AFP介于20～400 ng/ml時(shí)，若連續(xù)監(jiān)測(cè)有持續(xù)升高的趨勢(shì)，對(duì)HCC的診斷也有價(jià)值［11］。雖然AFP在腫瘤的早期篩查和治療中有重要的作用，但仍有30%～40%的HCC患者的AFP陰性，并且近年來AFP陰性或低滴度AFP的HCC患者逐漸增多；另外病毒性肝炎活動(dòng)期或肝硬化等因素也會(huì)導(dǎo)致 AFP 假陽性［12，13］。因此，尋找特異性的 HCC生物學(xué)標(biāo)志物或特定的治療靶點(diǎn)對(duì)HCC的治療及預(yù)后有著重要意義。

ACY－1是一種廣泛分布于各種組織的胞質(zhì)酶，主要參與生物體內(nèi)氨基酸代謝，專一水解N－?；璍－氨基酸的酰胺鍵形成L－氨基酸，而L－氨基酸參與機(jī)體代謝過程，具有生理活性。遺傳性ACY－1表達(dá)缺失會(huì)造成代謝異常，從而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。ACY－1在許多腫瘤疾病，如小細(xì)胞肺癌，腎細(xì)胞癌，直腸癌及神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)都被廣泛報(bào)道［14］，在肺癌和腎癌中ACY－1被報(bào)道為一種抑癌基因，但其在肝癌中鮮有報(bào)道。腫瘤組織中ACY－1表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵犯密切相關(guān)。腎癌中，利用小干擾RNA技術(shù)沉默ACY－1表達(dá)后，HCT116細(xì)胞增殖能力減弱，凋亡細(xì)胞比例增加。ACY－1可以被分泌到外周血中，但大部分的腎移植受者在移植前及后的血清中ACY－1很難被檢測(cè)到。而高達(dá)65%的發(fā)生移植腎功能延遲恢復(fù)的移植受者，血清中的ACY－1會(huì)顯著升高，因此ACY－1可以作為腎移植長(zhǎng)期預(yù)后評(píng)判的重要血清標(biāo)志物。這提示，ACY－1也可能同樣有作為HCC血清分子標(biāo)志物的潛在應(yīng)用價(jià)值。

該研究結(jié)果顯示，相對(duì)于配對(duì)癌旁組織，HCC組織中的ACY－1 mRNA表達(dá)下調(diào)。同mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致，Western Blot結(jié)果也表明，ACY－1蛋白在肝癌中的表達(dá)低于癌旁組織。這與之前在小細(xì)胞肺癌和腎癌中的報(bào)道一致［15］，但與ACY－1在結(jié)直腸癌中的報(bào)道不同。結(jié)直腸癌組織中ACY－1的表達(dá)則上調(diào)，而ACY－1在結(jié)直腸癌組織中的高表達(dá)預(yù)示著結(jié)直腸癌患者的預(yù)后不良。ACY－1的缺失可能參與了肝癌發(fā)生發(fā)展并起到促進(jìn)作用。有研究報(bào)道，ACY－1可以聯(lián)合CD34和泛素樣結(jié)合蛋白p62（sequestosome 1）作為區(qū)分小肝細(xì)胞癌和增生性結(jié)節(jié)的潛在免疫組化標(biāo)志物［10］。 另外，ACY－1聯(lián)合sequestosome－1和glypican－3也可以區(qū)分高分化肝癌和增生性結(jié)節(jié)［10］。因此試驗(yàn)中結(jié)合免疫組化的方法，對(duì)手術(shù)切除、病理科存檔的HCC患者石蠟標(biāo)本中ACY－1蛋白的表達(dá)水平及其與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)癌旁組織中ACY－1蛋白水平明顯高于肝癌組織。與此同時(shí)，ACY－1蛋白的表達(dá)水平與血清中AFP的水平密切相關(guān)，但與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織分化程度及HBV感染因素?zé)o關(guān)。提示不同年齡、不同性別的HCC組織中的ACY－1的表達(dá)沒有特異性；同時(shí)ACY－1的表達(dá)與患者腫瘤大小、組織分化程度無關(guān)，提示其與肝癌進(jìn)展情況及惡性程度無關(guān)。另外，由于AFP的陽性率只有60%左右，而在部分AFP正常（＜20 ng/ml）的HCC患者中也存在ACY－1基因的低表達(dá)，或許ACY－1作為肝癌腫瘤標(biāo)志物的診斷價(jià)值需要以正常人群作為對(duì)照進(jìn)行研究。

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