馬梓承，古金元，彭　濤，王玉超，劉照虎，孟凡亮，王宏宇，胡東方，劉思當(dāng)

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安　271000）

豬丹毒是由紅斑丹毒絲菌（以下簡稱丹毒絲菌）引起的一種急性熱性傳染病，表現(xiàn)為高熱性敗血癥、亞急性皮膚疹塊和慢性疣狀心內(nèi)膜炎，以及多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎[1]，是在全球流行的一種重要豬病，也是我國主要的豬傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。丹毒絲菌可感染脊椎動物和無脊椎動物，包括家畜、禽類和人，其中豬最敏感，主要感染3～12 月齡豬，引起的發(fā)病率一般為10%～15%，嚴(yán)重時死亡率可達(dá)50%。

豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）和豬圓環(huán)病毒（PCV2）是國內(nèi)豬場的常見病原，也是對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的病原，常引起條件致病菌的繼發(fā)感染。PRRSV歸屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬。患病豬臨床表現(xiàn)為厭食、高熱，母豬懷孕后期流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎。近年來我國流行的豬藍(lán)耳病基本上是由高致病性毒株所致，對易感豬群具有極高的死亡率，病理變化以急性彌漫性間質(zhì)性肺炎及全身敗血癥病變?yōu)樘卣鳌CV2為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，可感染各年齡的豬，使感染豬發(fā)生嚴(yán)重的免疫抑制。成年豬感染PCV2后，一般不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，仔豬感染后常引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征。

1　病例背景

山東省高密市某豬場飼養(yǎng)育肥豬1 200頭。豬群免疫程序：仔豬出生3 d后，進(jìn)行偽狂犬病疫苗滴鼻；1月齡首免口蹄疫油苗和豬瘟活苗，隔1個月再加強(qiáng)免疫1次。未進(jìn)行豬藍(lán)耳病和圓環(huán)病毒病疫苗免疫。2017年8月，豬群突然發(fā)生高熱性疾病，部分病豬死前體溫高達(dá)43 ℃，病死亡率為80%左右。豬場獸醫(yī)懷疑為急性豬丹毒，對病豬注射青霉素和板藍(lán)根注射液，但效果不佳，未抑制豬群死亡。

2　臨床癥狀與剖檢

病豬主要表現(xiàn)精神極度沉郁，虛弱，臥地不起，不愿走動，行走時步態(tài)僵硬；全身發(fā)紅或有明顯的紅色疹塊，耳朵呈紫紅色，體表淋巴結(jié)腫大；高熱，體溫在42 ℃左右；呼吸困難，黏膜發(fā)紺，急性死亡。

剖殺送檢病豬，發(fā)現(xiàn)病豬呈敗血癥病變（圖1）：全身淋巴結(jié)呈暗紅色，腫大、出血，呈漿液性出血性炎癥；腎臟腫大，呈暗紅色淤血；脾臟呈櫻桃紅色，腫大、充血，呈急性脾炎病變；肺腫脹，呈暗紅色，并見間質(zhì)水腫；胃腸道黏膜呈現(xiàn)不同程度的卡他性或出血性炎癥；肝臟腫脹，呈暗紅色。

采集組織器官病料（肺臟、脾臟、肝臟、腎臟、腦、淋巴結(jié)及扁桃體）。其中，一份用液氮保存，用于病原學(xué)檢測；另一份用10%福爾馬林溶液固定，用于病理組織學(xué)檢查。同時，自肺臟及肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

3　實驗室檢測

3.1　病毒PCR檢測

將凍存于液氮中的組織病料解凍后，取適量加入滅菌PBS并研磨成勻漿，12 000 r/min離心8 min，取上清，使用北京全式金EasyPure Viral DNA/RNA kit（批號K30217）提取病毒核酸。根據(jù)不同病毒的保守基因序列及參考文獻(xiàn)，分別設(shè)計豬瘟病毒（CSFV）、藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、偽狂犬病病毒（PRV）及豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的特異性引物（表1）。引物經(jīng)驗證均具有較好的特異性和擴(kuò)增效率。將提取的核算用PCR/RT-PCR方法擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外凝膠成像儀下根據(jù)條帶位置判定病豬的病原感染狀況。結(jié)果顯示，該病例存在PRRSV和PCV2感染（圖2）。

圖1　臨床剖檢病理變化

表1　PCR/RT-PCR引物序列

3.2　細(xì)菌分離鑒定

3.2.1初步分離培養(yǎng) 用血瓊脂平板培養(yǎng)基，自肝臟和肺臟中分離細(xì)菌；將培養(yǎng)基于37 ℃溫箱中培養(yǎng)1 d后取出，觀察血平板中菌落生長情況。

圖2　瓊脂糖凝膠電泳圖（病毒）

3.2.2PCR鑒定及測序 在平板中根據(jù)不同菌落大小和形態(tài)，分別用滅菌白色槍頭挑選完整菌落，打入20 μL滅菌PBS中，充分混合，反復(fù)吹打，直至PBS變渾濁且無菌體沉淀。本試驗共挑取了12個原始菌落。將所取的12個菌落分別用16S（生工合成）進(jìn)行PCR鑒定。引物序列為F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。20 μL體系為：酶10 μL、水5 μL、混合菌液3 μL，上下游引物各1 μL。根據(jù)電泳結(jié)果（圖3）可知，1、2、3、7、10號菌落出現(xiàn)了條帶。將其PCR產(chǎn)物送公司（生工）測序，對得到的基因序列與NCBI比對，證實1、2、10號菌落為丹毒絲菌，3、7號為類芽孢桿菌。

據(jù)了解，津巴布韋農(nóng)業(yè)投入品市場由當(dāng)?shù)厮綘I和國際公司主導(dǎo)，這些公司利用政府增加的農(nóng)業(yè)支持計劃，提高自己的利潤，加強(qiáng)在該國的業(yè)務(wù)。

圖3　瓊脂糖凝膠電泳圖（細(xì)菌）

3.2.3再提純培養(yǎng) 將之前稀釋的1、2、10號菌液從4 ℃冰箱中取出，用滅菌槍頭，將其滴到血平板上，用涂菌棒涂勻，放入37 ℃溫箱中培養(yǎng)1 d后，可見小的圓形菌落，直徑為0.5～1 mm；同樣條件培養(yǎng)2 d后，菌落直徑增至0.5～1.5 mm。菌落有光滑型和粗糙型兩種，有時也能觀察到中間型（圖4）。將純化好的菌落接種到5 mL含有10%犢牛血清的馬丁肉湯中，在37 ℃搖床中200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h；將菌液與甘油以2:1的比例混勻，放入1.5 mL離心管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

圖4　丹毒絲菌提純培養(yǎng)及革蘭氏染色鏡檢

3.2.4鑒定 革蘭氏染色：取甘油菌凃板的單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，可見藍(lán)紫色、細(xì)小的短桿菌，亦見有少量絲狀長桿菌，符合丹毒絲菌的鏡檢形態(tài)。生化實驗：對純化的可疑菌落按照青島海博生物技術(shù)公司提供的生化鑒定試劑盒進(jìn)行葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、枸櫞酸鹽、硝酸鹽、VP、MR等生化試驗，發(fā)現(xiàn)該菌能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖等，不能發(fā)酵甘露糖、蔗糖、木糖醇，硫化氫試驗陽性，甘露醇、MR、VP和接觸酶試驗均呈陰性（表2）。將細(xì)菌純培養(yǎng)物接種到生化管中，發(fā)現(xiàn)該菌能發(fā)酵葡萄糖，乳糖、麥芽糖、果糖等，不能發(fā)酵木糖醇，甘露醇和蔗糖，且MR、VP均為陰性，硫化氫試驗陽性。由此，該細(xì)菌的生化試驗鑒定結(jié)果與丹毒絲菌相符合。特異性引物PCR鑒定：根據(jù)文獻(xiàn)[2]合成擴(kuò)增的丹毒絲菌SpaA基因片段特異性引物為Erko-1F：5'-GTGAAACACCGTATTTTAGTA-3′；Erko-2R：5′-TTCAAGAAGTTCCTGTAGTTT-3′。預(yù)期擴(kuò)增出的目的基因片段長度為432 bp。反應(yīng)體系（總體積20 μL）：Premix Taq TaKaRa 10 μL、水5 μL，引物各1 μL，丹毒絲菌液3 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；35個循環(huán)的擴(kuò)增（94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）；最后72 ℃，再延伸5 min。對PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。共進(jìn)行了8個樣品的電泳驗證，發(fā)現(xiàn)均出現(xiàn)432 bp條帶，符合丹毒絲菌特性（圖5）。

3.2.5分離株SD-GM2017基因序列同源性比較及遺傳進(jìn)化分析 采用Editseq和 Megalign分子生物學(xué)軟件，對SpaA基因測序結(jié)果進(jìn)行同源性比較并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6、圖7）。結(jié)果表明，分離株與NCBI已發(fā)表SpaA基因序列核苷酸同源性為98.9%～99.9%。其中，與2014年4月分離自我國東部的YC13115株（KJ645079.1）和2014年6月分離自我國東部的HX130709株（KJ645074）同源性為100%。由于該菌株分離自我國東部的高密市，與我國東部2014年分離株XC130710（KJ645075.1）和同年分離株GHT10（KJ645072.1）核苷酸同源性達(dá)到99.8%，與另3例分離株NZ130701（KJ645073.1）、SY091027（KJ645080.1）、SY1027（CP005079）的核苷酸同源性也較高，達(dá)到99.5%。因此，將分離株的血清型確定為1a型。

表2　生化鑒定結(jié)果

圖5　瓊脂糖凝膠電泳圖（豬丹毒）

圖6　分離株SD-GM2017基因全長的核苷酸序列進(jìn)化樹

圖7　不同分離菌株SpaA基因核苷酸序列同源分析

3.3　藥敏試驗

按常規(guī)方法，取0.5 mL菌液均勻涂布于血平板；分別將恩諾沙星、頭孢噻呋、阿莫西林、鏈霉素、青霉素、林可霉素藥敏片置于該平板上，貼放后用鑷子輕壓；37 ℃培養(yǎng)16～24 h，測量抑菌圈直徑（φ）。結(jié)果顯示：恩諾沙星、頭孢噻呋、阿莫西林φ分別為25、18、8 mm，青霉素、鏈霉素、林可霉素?zé)o抑菌圈。根據(jù)抑菌環(huán)大小，確定本細(xì)菌對恩諾沙星和頭孢噻呋較敏感，特別是對恩諾沙星極度敏感。

3.4　病理切片觀察

取用福爾馬林溶液固定好的病料，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)組織病理變化主要表現(xiàn)為急性間質(zhì)性肺炎、輕度病毒性腦炎、急性間質(zhì)性腎炎、漿液性或壞死性淋巴結(jié)炎、間質(zhì)性心肌炎及間質(zhì)性肝炎（圖8）。

圖8　組織病理切片

4　病因分析及防控措施

根據(jù)臨床觀察、病例剖檢、實驗室檢測結(jié)果分析，確定本病例因同時感染PRRSV 和PCV2，導(dǎo)致機(jī)體免疫抵抗力下降，造成急性豬丹毒暴發(fā)，印證了起于病毒病，死于細(xì)菌病的說法。病豬呈急性敗血癥死亡。經(jīng)藥敏試驗得知，本病例中的丹毒絲菌對恩諾沙星極度敏感，而對青霉素耐藥，致使在疫情暴發(fā)的第一時間使用青霉素注射，并未及時制止該病蔓延，造成了巨大損失。

基于診斷結(jié)果和病因分析，及時調(diào)整豬場免疫程序，對未發(fā)病豬群緊急免疫藍(lán)耳病經(jīng)典毒株活疫苗，全群用包被恩諾沙星和黃芪多糖拌料防治，對病豬注射恩諾沙星針劑，連續(xù)用藥5 d，及時控制了疫情。

4.1　誘發(fā)原因

4.1.1疏于防范 豬丹毒是細(xì)菌病，可以用藥物治療，故一般農(nóng)戶對本病防控不夠重視，很少注射疫苗，因而疏于防范成為誘發(fā)本病的重要原因。

4.1.2多種因素導(dǎo)致豬群抵抗力下降 混合感染、繼發(fā)感染、免疫抑制等都是近幾年豬病難防的重要原因，尤其是PRRSV和PCV2感染可導(dǎo)致豬群免疫力大幅下降，使得其他病原菌有了可乘之機(jī)。

4.1.3季節(jié)與飼養(yǎng)管理因素 8、9月份正值高溫季節(jié)，氣候濕熱，豬處于熱應(yīng)激狀態(tài)，環(huán)境又非常適于丹毒絲菌生存，從而導(dǎo)致豬丹毒疫情暴發(fā)。飼養(yǎng)管理中，突然更換日糧、轉(zhuǎn)群等應(yīng)激都為本病發(fā)生提供了條件。

4.2　防控措施

4.2.1提高警惕 金璐娟等[3]在2006年從44只突然發(fā)病死亡的豬群中分離到了豬丹毒絲菌，反映出豬丹毒在某些豬場流行嚴(yán)重。2008年周緒斌等[4]對我國10個省市的36個豬場進(jìn)行了豬丹毒流行病學(xué)調(diào)查，選取近1年內(nèi)未注射過任何豬丹毒疫苗的豬場進(jìn)行統(tǒng)計與分析。結(jié)果顯示，在所有33個豬場中，29個豬場檢測出了豬丹毒陽性，陽性率高達(dá)87.88%，種豬檢測樣品陽性率為14.19%（110/775）。由此可見，豬丹毒的流行不可小覷，尤其是種豬群的慢性感染。豬場有必要進(jìn)行豬丹毒疫苗免疫。

4.2.2降低應(yīng)激，增強(qiáng)免疫 做好防暑降溫工作，慎防天氣突變帶來的應(yīng)激，可在飼料或者飲水中添加多維、黃芪多糖等抗應(yīng)激、提高免疫力藥物。

4.2.3堅持自繁自養(yǎng)，安全引種 要堅持自繁自養(yǎng)，全進(jìn)全出制，保證自家豬群不受外來未知豬群影響，以免給豬群帶來巨大風(fēng)險。

4.2.4避免抗生素濫用 加強(qiáng)耐藥性檢測，選用合適抗生素，采取輪轉(zhuǎn)用藥、穿梭用藥、交替用藥等方式，將抗生素耐藥性風(fēng)險降低到最低。

4.2.5加強(qiáng)飼養(yǎng)管理 堅持做好豬舍衛(wèi)生，定期消毒，保持豬舍清潔、通風(fēng)，及時處理糞便，防止飲水和飼料污染，保持舍內(nèi)溫度恒定。

4.2.6疫苗預(yù)防 做好豬藍(lán)耳病和圓環(huán)病毒病免疫。對豬丹毒流行豬場，建議每年春秋季定期進(jìn)行豬丹毒疫苗免疫接種。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳溥言. 獸醫(yī)傳染病學(xué)[M]. 5版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[2] 鄒垚. 豬丹毒桿菌的分離鑒定和免疫特性分析[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[3] 金璐娟，劉景霞，王迪. 肉仔雞紅斑丹毒絲菌感染的診治[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2008，44（8）：73-74.

[4] 周緒斌，丹尼，李聰，等. 豬丹毒——古老的傳染病是否從中國規(guī)?；i場消失了？[J].今日養(yǎng)豬業(yè)，2009，5：22-24.