馬梓承，古金元，彭　濤，王玉超，劉照虎，孟凡亮，王宏宇，胡東方，劉思當

（山東農業(yè)大學動物科技學院，山東泰安　271000）

豬丹毒是由紅斑丹毒絲菌（以下簡稱丹毒絲菌）引起的一種急性熱性傳染病，表現為高熱性敗血癥、亞急性皮膚疹塊和慢性疣狀心內膜炎，以及多發(fā)性非化膿性關節(jié)炎[1]，是在全球流行的一種重要豬病，也是我國主要的豬傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重經濟損失。丹毒絲菌可感染脊椎動物和無脊椎動物，包括家畜、禽類和人，其中豬最敏感，主要感染3～12 月齡豬，引起的發(fā)病率一般為10%～15%，嚴重時死亡率可達50%。

豬藍耳病病毒（PRRSV）和豬圓環(huán)病毒（PCV2）是國內豬場的常見病原，也是對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經濟損失的病原，常引起條件致病菌的繼發(fā)感染。PRRSV歸屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬?；疾∝i臨床表現為厭食、高熱，母豬懷孕后期流產，產死胎和木乃伊胎。近年來我國流行的豬藍耳病基本上是由高致病性毒株所致，對易感豬群具有極高的死亡率，病理變化以急性彌漫性間質性肺炎及全身敗血癥病變?yōu)樘卣?。PCV2為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，可感染各年齡的豬，使感染豬發(fā)生嚴重的免疫抑制。成年豬感染PCV2后，一般不表現明顯的臨床癥狀，仔豬感染后常引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征。

1　病例背景

山東省高密市某豬場飼養(yǎng)育肥豬1 200頭。豬群免疫程序：仔豬出生3 d后，進行偽狂犬病疫苗滴鼻；1月齡首免口蹄疫油苗和豬瘟活苗，隔1個月再加強免疫1次。未進行豬藍耳病和圓環(huán)病毒病疫苗免疫。2017年8月，豬群突然發(fā)生高熱性疾病，部分病豬死前體溫高達43 ℃，病死亡率為80%左右。豬場獸醫(yī)懷疑為急性豬丹毒，對病豬注射青霉素和板藍根注射液，但效果不佳，未抑制豬群死亡。

2　臨床癥狀與剖檢

病豬主要表現精神極度沉郁，虛弱，臥地不起，不愿走動，行走時步態(tài)僵硬；全身發(fā)紅或有明顯的紅色疹塊，耳朵呈紫紅色，體表淋巴結腫大；高熱，體溫在42 ℃左右；呼吸困難，黏膜發(fā)紺，急性死亡。

剖殺送檢病豬，發(fā)現病豬呈敗血癥病變（圖1）：全身淋巴結呈暗紅色，腫大、出血，呈漿液性出血性炎癥；腎臟腫大，呈暗紅色淤血；脾臟呈櫻桃紅色，腫大、充血，呈急性脾炎病變；肺腫脹，呈暗紅色，并見間質水腫；胃腸道黏膜呈現不同程度的卡他性或出血性炎癥；肝臟腫脹，呈暗紅色。

采集組織器官病料（肺臟、脾臟、肝臟、腎臟、腦、淋巴結及扁桃體）。其中，一份用液氮保存，用于病原學檢測；另一份用10%福爾馬林溶液固定，用于病理組織學檢查。同時，自肺臟及肝臟進行細菌分離鑒定。

3　實驗室檢測

3.1　病毒PCR檢測

將凍存于液氮中的組織病料解凍后，取適量加入滅菌PBS并研磨成勻漿，12 000 r/min離心8 min，取上清，使用北京全式金EasyPure Viral DNA/RNA kit（批號K30217）提取病毒核酸。根據不同病毒的保守基因序列及參考文獻，分別設計豬瘟病毒（CSFV）、藍耳病病毒（PRRSV）、偽狂犬病病毒（PRV）及豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的特異性引物（表1）。引物經驗證均具有較好的特異性和擴增效率。將提取的核算用PCR/RT-PCR方法擴增，將擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外凝膠成像儀下根據條帶位置判定病豬的病原感染狀況。結果顯示，該病例存在PRRSV和PCV2感染（圖2）。

圖1　臨床剖檢病理變化

表1　PCR/RT-PCR引物序列

3.2　細菌分離鑒定

3.2.1初步分離培養(yǎng) 用血瓊脂平板培養(yǎng)基，自肝臟和肺臟中分離細菌；將培養(yǎng)基于37 ℃溫箱中培養(yǎng)1 d后取出，觀察血平板中菌落生長情況。

圖2　瓊脂糖凝膠電泳圖（病毒）

3.2.2PCR鑒定及測序 在平板中根據不同菌落大小和形態(tài)，分別用滅菌白色槍頭挑選完整菌落，打入20 μL滅菌PBS中，充分混合，反復吹打，直至PBS變渾濁且無菌體沉淀。本試驗共挑取了12個原始菌落。將所取的12個菌落分別用16S（生工合成）進行PCR鑒定。引物序列為F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。20 μL體系為：酶10 μL、水5 μL、混合菌液3 μL，上下游引物各1 μL。根據電泳結果（圖3）可知，1、2、3、7、10號菌落出現了條帶。將其PCR產物送公司（生工）測序，對得到的基因序列與NCBI比對，證實1、2、10號菌落為丹毒絲菌，3、7號為類芽孢桿菌。

據了解，津巴布韋農業(yè)投入品市場由當地私營和國際公司主導，這些公司利用政府增加的農業(yè)支持計劃，提高自己的利潤，加強在該國的業(yè)務。

圖3　瓊脂糖凝膠電泳圖（細菌）

3.2.3再提純培養(yǎng) 將之前稀釋的1、2、10號菌液從4 ℃冰箱中取出，用滅菌槍頭，將其滴到血平板上，用涂菌棒涂勻，放入37 ℃溫箱中培養(yǎng)1 d后，可見小的圓形菌落，直徑為0.5～1 mm；同樣條件培養(yǎng)2 d后，菌落直徑增至0.5～1.5 mm。菌落有光滑型和粗糙型兩種，有時也能觀察到中間型（圖4）。將純化好的菌落接種到5 mL含有10%犢牛血清的馬丁肉湯中，在37 ℃搖床中200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h；將菌液與甘油以2:1的比例混勻，放入1.5 mL離心管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

圖4　丹毒絲菌提純培養(yǎng)及革蘭氏染色鏡檢

3.2.4鑒定 革蘭氏染色：取甘油菌凃板的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，可見藍紫色、細小的短桿菌，亦見有少量絲狀長桿菌，符合丹毒絲菌的鏡檢形態(tài)。生化實驗：對純化的可疑菌落按照青島海博生物技術公司提供的生化鑒定試劑盒進行葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、枸櫞酸鹽、硝酸鹽、VP、MR等生化試驗，發(fā)現該菌能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖等，不能發(fā)酵甘露糖、蔗糖、木糖醇，硫化氫試驗陽性，甘露醇、MR、VP和接觸酶試驗均呈陰性（表2）。將細菌純培養(yǎng)物接種到生化管中，發(fā)現該菌能發(fā)酵葡萄糖，乳糖、麥芽糖、果糖等，不能發(fā)酵木糖醇，甘露醇和蔗糖，且MR、VP均為陰性，硫化氫試驗陽性。由此，該細菌的生化試驗鑒定結果與丹毒絲菌相符合。特異性引物PCR鑒定：根據文獻[2]合成擴增的丹毒絲菌SpaA基因片段特異性引物為Erko-1F：5'-GTGAAACACCGTATTTTAGTA-3′；Erko-2R：5′-TTCAAGAAGTTCCTGTAGTTT-3′。預期擴增出的目的基因片段長度為432 bp。反應體系（總體積20 μL）：Premix Taq TaKaRa 10 μL、水5 μL，引物各1 μL，丹毒絲菌液3 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；35個循環(huán)的擴增（94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）；最后72 ℃，再延伸5 min。對PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。共進行了8個樣品的電泳驗證，發(fā)現均出現432 bp條帶，符合丹毒絲菌特性（圖5）。

3.2.5分離株SD-GM2017基因序列同源性比較及遺傳進化分析 采用Editseq和 Megalign分子生物學軟件，對SpaA基因測序結果進行同源性比較并繪制系統發(fā)育樹（圖6、圖7）。結果表明，分離株與NCBI已發(fā)表SpaA基因序列核苷酸同源性為98.9%～99.9%。其中，與2014年4月分離自我國東部的YC13115株（KJ645079.1）和2014年6月分離自我國東部的HX130709株（KJ645074）同源性為100%。由于該菌株分離自我國東部的高密市，與我國東部2014年分離株XC130710（KJ645075.1）和同年分離株GHT10（KJ645072.1）核苷酸同源性達到99.8%，與另3例分離株NZ130701（KJ645073.1）、SY091027（KJ645080.1）、SY1027（CP005079）的核苷酸同源性也較高，達到99.5%。因此，將分離株的血清型確定為1a型。

表2　生化鑒定結果

圖5　瓊脂糖凝膠電泳圖（豬丹毒）

圖6　分離株SD-GM2017基因全長的核苷酸序列進化樹

圖7　不同分離菌株SpaA基因核苷酸序列同源分析

3.3　藥敏試驗

按常規(guī)方法，取0.5 mL菌液均勻涂布于血平板；分別將恩諾沙星、頭孢噻呋、阿莫西林、鏈霉素、青霉素、林可霉素藥敏片置于該平板上，貼放后用鑷子輕壓；37 ℃培養(yǎng)16～24 h，測量抑菌圈直徑（φ）。結果顯示：恩諾沙星、頭孢噻呋、阿莫西林φ分別為25、18、8 mm，青霉素、鏈霉素、林可霉素無抑菌圈。根據抑菌環(huán)大小，確定本細菌對恩諾沙星和頭孢噻呋較敏感，特別是對恩諾沙星極度敏感。

3.4　病理切片觀察

取用福爾馬林溶液固定好的病料，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察，發(fā)現組織病理變化主要表現為急性間質性肺炎、輕度病毒性腦炎、急性間質性腎炎、漿液性或壞死性淋巴結炎、間質性心肌炎及間質性肝炎（圖8）。

圖8　組織病理切片

4　病因分析及防控措施

根據臨床觀察、病例剖檢、實驗室檢測結果分析，確定本病例因同時感染PRRSV 和PCV2，導致機體免疫抵抗力下降，造成急性豬丹毒暴發(fā)，印證了起于病毒病，死于細菌病的說法。病豬呈急性敗血癥死亡。經藥敏試驗得知，本病例中的丹毒絲菌對恩諾沙星極度敏感，而對青霉素耐藥，致使在疫情暴發(fā)的第一時間使用青霉素注射，并未及時制止該病蔓延，造成了巨大損失。

基于診斷結果和病因分析，及時調整豬場免疫程序，對未發(fā)病豬群緊急免疫藍耳病經典毒株活疫苗，全群用包被恩諾沙星和黃芪多糖拌料防治，對病豬注射恩諾沙星針劑，連續(xù)用藥5 d，及時控制了疫情。

4.1　誘發(fā)原因

4.1.1疏于防范 豬丹毒是細菌病，可以用藥物治療，故一般農戶對本病防控不夠重視，很少注射疫苗，因而疏于防范成為誘發(fā)本病的重要原因。

4.1.2多種因素導致豬群抵抗力下降 混合感染、繼發(fā)感染、免疫抑制等都是近幾年豬病難防的重要原因，尤其是PRRSV和PCV2感染可導致豬群免疫力大幅下降，使得其他病原菌有了可乘之機。

4.1.3季節(jié)與飼養(yǎng)管理因素 8、9月份正值高溫季節(jié)，氣候濕熱，豬處于熱應激狀態(tài)，環(huán)境又非常適于丹毒絲菌生存，從而導致豬丹毒疫情暴發(fā)。飼養(yǎng)管理中，突然更換日糧、轉群等應激都為本病發(fā)生提供了條件。

4.2　防控措施

4.2.1提高警惕 金璐娟等[3]在2006年從44只突然發(fā)病死亡的豬群中分離到了豬丹毒絲菌，反映出豬丹毒在某些豬場流行嚴重。2008年周緒斌等[4]對我國10個省市的36個豬場進行了豬丹毒流行病學調查，選取近1年內未注射過任何豬丹毒疫苗的豬場進行統計與分析。結果顯示，在所有33個豬場中，29個豬場檢測出了豬丹毒陽性，陽性率高達87.88%，種豬檢測樣品陽性率為14.19%（110/775）。由此可見，豬丹毒的流行不可小覷，尤其是種豬群的慢性感染。豬場有必要進行豬丹毒疫苗免疫。

4.2.2降低應激，增強免疫 做好防暑降溫工作，慎防天氣突變帶來的應激，可在飼料或者飲水中添加多維、黃芪多糖等抗應激、提高免疫力藥物。

4.2.3堅持自繁自養(yǎng)，安全引種 要堅持自繁自養(yǎng)，全進全出制，保證自家豬群不受外來未知豬群影響，以免給豬群帶來巨大風險。

4.2.4避免抗生素濫用 加強耐藥性檢測，選用合適抗生素，采取輪轉用藥、穿梭用藥、交替用藥等方式，將抗生素耐藥性風險降低到最低。

4.2.5加強飼養(yǎng)管理 堅持做好豬舍衛(wèi)生，定期消毒，保持豬舍清潔、通風，及時處理糞便，防止飲水和飼料污染，保持舍內溫度恒定。

4.2.6疫苗預防 做好豬藍耳病和圓環(huán)病毒病免疫。對豬丹毒流行豬場，建議每年春秋季定期進行豬丹毒疫苗免疫接種。

參考文獻：

[1] 陳溥言. 獸醫(yī)傳染病學[M]. 5版. 北京：中國農業(yè)出版社，2006.

[2] 鄒垚. 豬丹毒桿菌的分離鑒定和免疫特性分析[D]. 南京：南京農業(yè)大學，2015.

[3] 金璐娟，劉景霞，王迪. 肉仔雞紅斑丹毒絲菌感染的診治[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2008，44（8）：73-74.

[4] 周緒斌，丹尼，李聰，等. 豬丹毒——古老的傳染病是否從中國規(guī)模化豬場消失了？[J].今日養(yǎng)豬業(yè)，2009，5：22-24.