施開創(chuàng)，覃　勇，尹彥文，唐云姣，黃百花

（1. 廣西動物疫病預防控制中心，廣西南寧　530001；2. 百色市動物疫病預防控制中心，廣西百色　533000）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）、豬瘟（Classical swine fever，CSF）、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS）是當前嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病。2017年前，我國對FMD、CSF和HP-PRRS實行強制免疫，2017年后只對FMD實行強制免疫，而對CSF和HP-PRRS實行全面免疫[1]。為提高免疫效果，許多學者開展了FMD、CSF、HP-PRRS疫苗不同免疫程序的免疫效果研究[2-7]。有研究發(fā)現，在原有“333法”免疫程序（即FMD、CSF、HP-PRRS疫苗先后間隔14 d免疫注射）基礎上開展的“332法”（即先用FMD滅活疫苗和CSF弱毒疫苗同時在頸部分點免疫注射，間隔14 d后再用HP-PRRS弱毒疫苗免疫注射）和“321法”免疫程序（即將HP-PRRS弱毒疫苗和CSF弱毒疫苗釋稀后混合為一針，將FMD滅活疫苗單獨為一針分別在頸部兩側同時分點注射）均有更好的免疫效果[8]，且“321法”優(yōu)于“332法”[9-10]。本研究在小規(guī)模試驗基礎上，于2014—2016年在廣西省百色市12個縣（市、區(qū)）135個鄉(xiāng)鎮(zhèn)進行了3種不同免疫程序的較大規(guī)模臨床試驗，以便為臨床大面積推廣應用提供依據。

1　材料與方法

1.1　疫苗

所使用疫苗為2014—2016年廣西政府招標采購疫苗。FMD O型滅活疫苗（OMYA98/BY/2010株）：中農威特生物科技股份有限公司、內蒙古必威安泰生物科技有限公司、新疆天康生物科技股份有限公司生產；CSF弱毒疫苗（細胞源）：成都天邦生物制品有限公司、廣西麗原生物股分有限公司生產；HP-PRRS弱毒疫苗（TJM-F92株）：吉林特研生物技術有限責任公司、新疆天康生物科技股份有限公司生產。每年均用同一廠家生產的疫苗。

1.2　主要試劑

FMD O型抗體液相阻斷ELISA試劑盒：中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所產品；豬瘟（CSF-Ab）抗體檢測試劑盒：韓國金諾公司產品；豬繁殖與呼吸綜合征抗體ELISA檢測試劑盒：法國LSI公司產品；口蹄疫病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒、豬瘟病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR檢測試劑盒：北京世紀元亨動物防疫技術有限公司產品。

1.3　試驗設計

免疫方式以春季、秋季集中免疫為主，常年定期補免為輔。2014—2016年在廣西百色市12個縣（市、區(qū)）135個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，根據地理位置和養(yǎng)殖規(guī)模、養(yǎng)殖習慣等情況，每個縣（市、區(qū)）隨機選取不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)，分別采用“333法”“332法”“321法”進行免疫（免疫劑量均為1 mL/頭份）。

血清樣品來源于每年春秋兩季集中強制免疫后，對轄區(qū)所有12個縣（市、區(qū)）進行驗收時隨機采集的樣品。分別采集應用“333法”“332法”“321法”免疫的血清2 799、5 180、4 114份。組織樣品（心、肝、脾、肺、腎、扁桃體、淋巴結等）來源于百色市12個縣（市、區(qū)）異常死亡豬。分別采集應用“333法”“332法”“321法”免疫程序的組織樣品383、1 167、595份。血清、組織樣品置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4　血清抗體檢測

血清抗體檢測均按照相應檢測試劑盒說明書進行。FMD O型病毒抗體判斷標準：對照臨界值，抗體效價＜1:64時判為陰性，1:64時判為可疑，≥1:128時判為陽性。CSF病毒抗體判定標準：PC＜40%時判為陰性，≥40 %時判為陽性。HPPRRS病毒抗體判定標準：IRPC≤20時判為陰性，＞20時判為陽性。

1.5　組織樣品病原檢測

組織樣品的病原檢測均按照相應檢測試劑盒說明書進行。被檢樣品出現131 bp擴增帶時判為FMD陽性，否則為陰性；被檢樣品出現235 bp擴增帶時判為CSF陽性，否則為陰性；被檢樣品出現278 bp擴增帶時判為HP-PRRS陽性，否則為陰性。

1.6　數據統計與分析

收集百色市12個縣（市、區(qū)）的生豬免疫數、發(fā)病數、死亡數（包括病死數、發(fā)病淘汰數）、免疫副反應數。利用Excel 2007進行數據統計，采用單因素方差分析法，對各種數據進行差異性分析。當P＜0.05時，判為差異顯著。

2　結果

2.1　免疫密度

百色市各縣（市、區(qū)）135個鄉(xiāng)鎮(zhèn)2014—2016年應用“333法”的FMD、CSF、HP-PRRS平均免疫密度分別為97.20%、95.27%、83.89%，應用“332法”的平均免疫密度分別為95.28%、95.28%、90.92%，應用“321法”的平均免疫密度均為96.24 %。與“333法”相比，“332法”和“321法”的HP-PRRS免疫密度均顯著提高（P＜0.05）、FMD和CSF的免疫密度則差異不顯著（P＞0.05）；與“332法”免疫程序相比，“321法”的HP-PRRS免疫密度顯著提高（P＜0.05），FMD和CSF免疫密度稍有提高，但差異不顯著（P＞0.05），具體結果見表1。

表1　FMD、CSF、HP-PRRS疫苗免疫密度 單位：%

2.2　抗體檢測

對百色市各縣（市、區(qū)）春秋集中強制免疫質量驗收時所采集的血清，應用ELISA方法進行抗體檢測。結果顯示：應用“333法”的FMD、CSF和HP-PRRS抗體陽性率分別為90.10%、89.10%、86.17%；應用“332法”的分別為94.25%、90.62%、90.58%；應用“321法”的分別為94.46%、91.66%、91.27%。與“333法”相比，“332法”和“321法”的HP-PRRS抗體陽性率均顯著提高（P＜0.05），FMD和CSF抗體陽性率有所提高，但差異不顯著（P＞0.05），具體結果見表2。

表2　FMDV、CSFV和HP-PRRSV抗體檢測結果 單位：%

2.3　病原檢測

應用RT-PCR方法，對從百色市各縣（市、區(qū)）采集的病死豬組織樣品進行病原檢測。結果顯示：3種不同免疫程序的FMD病原檢測均為陰性；與“333法”相比，“332法”和“321法”的CSF病原陽性率均有所降低，但差異不顯著（P＞0.05），而HP-PRRS陽性率則顯著降低（P＜0.05）；“321法”與“332法”相比，CSF、HPPRRS病原陽性率有所下降，但差異不顯著（表3）。

表3　FMD、CSF和HP-PRRS病原檢測結果　單位：%

2.4　生豬發(fā)病率、死亡率和免疫副反應率

經統計百色市各縣（市、區(qū)）數據，與“333法”相比，應用“332法”和“321法”的生豬發(fā)病率、死亡率均顯著降低（P＜0.05），而免疫副反應率稍有增加，但差異不顯著（P＞0.05）；“321法”與“332法”相比，發(fā)病率、死亡率顯著下降（P＜0.05），而免疫副反應率有所增加，但差異不顯著（P＞0.05）（表4）。

表4　生豬的發(fā)病率、死亡率和免疫副反應率　單位：%

2.5　綜合評價

綜合分析各項考核指標發(fā)現，與“333法”免疫程序相比，“332法”和“321法”的HP-PRRS免疫密度及其抗體陽性率顯著提高，HP-PRRS病原陽性率、生豬發(fā)病率、死亡率顯著下降；與“332法”相比，“321法”的HP-PRRS免疫密度顯著提高，病原陽性率以及生豬發(fā)病率、死亡率顯著下降（表5）。結果表明，3種免疫程序對FMD和CSF的免疫效果差異不大，而對HP-PRRS的免疫效果則顯著提高，總體而言，“332法”和“321法”均優(yōu)于“333法”，而“321法”又優(yōu)于“332法”。

3　討論

許多學者為簡化免疫程序，減少免疫次數，提高免疫效果，針對FMD、CSF、HP-PRRS疫苗開展了大量免疫試驗。張長龍等[2]采用3種疫苗同時分點免疫，發(fā)現3種疫苗間相互干擾較大，CSF抗體產生時間推遲；而先接種CSF疫苗，7 d后接種FMD和HP-PRRS疫苗，后兩者具有協同促進作用。竇鵬勛等[3]報道，CSF、FMD、HPPRRS疫苗同時免疫可取得理想的免疫效果，FMD與HP-PRRS疫苗同時免疫具有協同作用，CSF和HP-PRRS疫苗同時免疫會相互影響。馬睿麟等[4]報道，CSF和HP-PRRS疫苗組合免疫，7 d后免疫FMD疫苗，發(fā)現FMD抗體較低；先免疫CSF疫苗，7 d后免疫FMD和HP-PRRS疫苗，CSF抗體受到干擾；FMD、CSF和PRRS 3種疫苗同時分點免疫或單獨免疫，免疫效果一致。任宇斕等[5]用FMD、CSF、HP-PRRS疫苗同時分點注射以及3種疫苗間隔7 d免疫注射，均取得了理想的免疫效果。盧景等[6]報道，FMD、CSF和HP-PRRS 3種疫苗同時分點免疫的抗體水平都低于單獨免疫；FMD和HP-PRRS疫苗或CSF和HP-PRRS疫苗同時分點免疫，均會相互干擾，但對7 d后免疫的CSF疫苗或FMD疫苗沒有影響；FMD和CSF疫苗同時分點免疫，7 d后再免疫HP-PRRS疫苗，產生的抗體效價與3種疫苗單獨免疫基本一致。陳文武等[7]報道，先免疫HP-PRRS疫苗，7 d后同時分點注射FMD和CSF疫苗，或者CSF、FMD、HP-PRRS 3種疫苗同時分點免疫注射，均會獲得較好的免疫效果；CSF和FMD同時免疫具有協同作用，CSF和HP-PRRS或FMD和HP-PRRS同時免疫會相互影響。以上報道與本研究結果并不完全一致。這可能與不同地域的氣候條件，飼養(yǎng)管理，豬的品種、年齡、健康狀況，疫苗種類，免疫程序，豬群基礎免疫，母源抗體水平等多種因素有關。

表5　“332法”“321法”與“333法”免疫程序各項考核指標比較

本研究選取的百色市地處廣西西部，與越南毗鄰，處于丘陵地帶；12個縣市的氣候條件相似，養(yǎng)殖習慣、養(yǎng)殖特點、豬群品種、飼養(yǎng)管理水平也基本相同。為避免疫苗種類對不同免疫程序免疫效果影響，百色市每年所使用的疫苗均為同一廠家疫苗。但在生產實踐中，難以完全控制其他因素。因此，本研究在采集血清和病料樣本時，盡可能擴大采樣的地域范圍、時間分布，增加采樣數量，以降低各種因素對免疫效果的影響。本研究結果顯示，3種免疫程序中，FMD和CSF的免疫效果沒有顯著差異，而HP-PRRS的免疫效果則有顯著差異。究其原因，是因為提高了HP-PRRS免疫密度，減少了應急因素。廣西邊境地區(qū)原來應用的是“333法”，需要抓3次豬，進行3次免疫。畜主因擔心多次抓豬會引起應激反應、免疫副反應等而影響生產性能，出現抵觸甚至拒絕后面的疫苗免疫，加上部分基層防疫人員責任心不強，導致免疫存在空白點，影響了免疫密度。本研究示范應用的“332法”和“321法”免疫程序，減少了抓豬和免疫注射次數，養(yǎng)殖戶樂于接受和配合，因而提高了免疫密度。HP-PRRS免疫密度的提高，有效減少了HP-PRRS的臨床發(fā)病率和死亡率。本研究顯示，即使經過疫苗免疫，仍可在病死豬組織中檢測到CSF和HP-PRRSV，說明免疫豬群中仍有CSF和HP-PRRS病原的存在和循環(huán)，因此必須對此高度重視，尤其是HP-PRRSV野毒株的感染[11-12]。

4　結論

本研究顯示，對于FMD和CSF而言，“333法”“332法”和“321法”免疫程序間的免疫密度、抗體陽性率、病原陽性率差異不顯著，即3種免疫程序的免疫效果相當；對HP-PRRS而言，這3種免疫程序間的免疫密度、抗體陽性率、病原陽性率、生豬發(fā)病率和死亡率差異顯著，“321法”的免疫效果最好。其原因主要是由于HP-PRRS免疫密度的提高，以及總免疫次數的減少，降低了生豬發(fā)病率、死亡率，減少了應激刺激。臨床上，可以根據實際情況優(yōu)先選擇應用“321法”，其次可選擇應用“332法”免疫程序。

參考文獻：

[1] 農業(yè)部、財政部. 關于調整完善動物疫病防控支持政策的通知：農醫(yī)發(fā)〔2016〕35號[A/OL].（2017-12-13）[2018-01-05]. http://www.moa.gov.cn/govpublic/SYJ/201607/t20160726_5217683.htm.

[2] 張長龍，嚴寶英，賈文孝，等. 豬瘟、豬口蹄疫、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗有效免疫試驗初探[J].動物醫(yī)學進展，2009，30（7）：101-103.

[3] 竇鵬勛，葛建強，張勇，等. 3種疫苗單獨和聯合免疫對豬抗體水平的影響[J]. 安徽農業(yè)科學，2009，37（31）：15259-15261.

[4] 馬睿麟，蔡金山，沈艷麗，等. 豬瘟、口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征等多種疫苗免疫試驗[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2010，42（10）：79-82.

[5] 任宇斕，于厚軍，蔣文生，等. 豬口蹄疫、豬瘟、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征三種疫苗不同組合同時分點免疫效果觀察與分析[J]. 中國動物檢疫，2011，28（5）：67-71.

[6] 盧景，陸承平，段振華. 口蹄疫、豬瘟和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征3種疫苗不同組合對豬的免疫效果評價[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2012，44（1）：76-79.

[7] 陳文武，馬長賓，崔蕾，等. FMD、HP-PRRS及CSF三種疫苗不同免疫組合同時分點免疫的抗體水平檢測[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016（3）：95-98.

[8] 胡杰，張步嫻，屈素潔，等. 不同免疫方式對仔豬免疫高致病性豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、豬口蹄疫三種疫苗抗體水平的影響[J]. 中國動物傳染病學報，2014，22（5）：61-67.

[9] 覃勇，趙聰，黃文炳，等. 口蹄疫、豬瘟、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征3種疫苗同步兩點免疫的田間應用試驗[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2017，44（8）：2450-2457.

[10] 覃勇，黃文炳，黃金山，等. 口蹄疫、豬瘟、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征三種疫苗同步兩點免疫在規(guī)模豬場的應用試驗[J]. 中國動物傳染病學報，2017，25（6）：21-29.

[11] ZHANG Q，XU X，YOU S，et al. Emerging of two new subgenotypes of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses in Southeast China[J]. Microbiological pathogen，2016，97：27-33.

[12] 楊漢春，周磊. 2016年豬病流行情況與2017年流行趨勢及防控對策[J]. 豬業(yè)科學，2017，34 （2）：36-37.