劉樹(shù)文， 羅麗麗

(貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550018)

葛仙米(NostocsphaeroidesKützing)學(xué)名擬球狀念珠藻，生長(zhǎng)于水稻田中，是我國(guó)傳統(tǒng)出口的一種珍貴野生藥食兩用固氮藍(lán)藻，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，食用歷史悠久[1]。其蛋白含量較高，含有豐富的人體必需的各種氨基酸、脂肪酸、維生素以及礦質(zhì)元素，并且含有具有藥用價(jià)值的各種多糖、色素等，還含有超氧化物歧化酶等生理活性物質(zhì)[1-2]。因此，它在保健食品、食品添加劑、動(dòng)物飼料、醫(yī)藥、美容以及精細(xì)化加工等領(lǐng)域具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[1-2]。葛仙米在世界范圍內(nèi)分布稀少，主要分布在我國(guó)湖北省鶴峰縣走馬鎮(zhèn)[1]，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)葛仙米的研究相對(duì)較少，對(duì)其開(kāi)發(fā)利用也沒(méi)有像小球藻、螺旋藻和鹽藻那樣已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[2]。為了合理地開(kāi)發(fā)利用葛仙米這種珍稀食品，對(duì)葛仙米的人工培養(yǎng)條件及生理特性的研究意義重大。

一些研究表明，水體的pH值影響藻類生長(zhǎng)和生理代謝以及藻類種群的演替，不同的藻類有不同的pH值適應(yīng)范圍[3-8]。pH值會(huì)影響藻類對(duì)無(wú)機(jī)碳及鐵等微量元素在水體中的存在形式，進(jìn)而影響藻類對(duì)無(wú)機(jī)碳和鐵等微量元素的吸收利用[8]，藻類在生長(zhǎng)過(guò)程中也會(huì)改變水體pH值[9]。水體pH值增加通常會(huì)引起藍(lán)藻占優(yōu)勢(shì)[10]。薛凌展等研究表明，銅綠微囊藻適合生長(zhǎng)的pH值為8～11，最佳pH值為9；而普通小球藻適合生長(zhǎng)的pH值為7～9，最佳pH值為8[11]。共同培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果顯示堿性環(huán)境中銅綠微囊藻的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)強(qiáng)于普通小球藻[11]。

本研究比較了不同pH值(6.0、7.0、8.0)對(duì)葛仙米生長(zhǎng)以及各種光合色素、可溶性糖、可溶性蛋白含量等方面的生理影響差異，并在培養(yǎng)液中加入pH值緩沖劑固定葛仙米生長(zhǎng)過(guò)程中的pH值，旨在發(fā)現(xiàn)人工培養(yǎng)野生葛仙米的最適合pH值，為野生葛仙米的規(guī)?；B(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

2015年4月從貴州省岑鞏縣開(kāi)本鄉(xiāng)沈家灣村采集得到新鮮野生葛仙米球形體。先將葛仙米球形體用無(wú)菌的蒸餾水沖洗干凈，再用75%乙醇溶液浸泡30 s，去雜藻雜菌，然后用無(wú)菌BG110培養(yǎng)液(不含NaNO3的BG11培養(yǎng)基)清洗3次。再放入葛仙米群體質(zhì)量1倍的BG110培養(yǎng)液，用玻璃勻漿器勻漿成絲狀藻漿，然后用無(wú)菌BG110培養(yǎng)液稀釋。培養(yǎng)溫度為 25 ℃，用30 W日光燈提供光照，光照度為1 500 lux。用空氣泵通入用0.22 μm濾膜過(guò)濾的無(wú)菌空氣，通氣量為 300 mL/min。經(jīng)過(guò)15 d的培養(yǎng)，得到無(wú)雜菌和雜藻的野生葛仙米藻種。

1.2　培養(yǎng)條件

葛仙米的培養(yǎng)采用BG110培養(yǎng)基，配制BG110時(shí)加入BICINE(N,N-二羥乙基甘氨酸)生物緩沖劑，緩沖劑濃度為20 mmol/L[8]，用0.1、1.0 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)BG110培養(yǎng)基pH值為 6.0、7.0、8.0，在121 ℃下滅菌30 min。藻種經(jīng)過(guò)勻漿之后分別接種到高壓滅菌后的9個(gè)500 mL錐形瓶，分別加入pH值為6.0、7.0、8.0的BG110培養(yǎng)基，藻液總體積為 450 mL/瓶，初始接種量按照葉綠素含量450 μg/mL。每組pH值條件設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)溫度為25 ℃，用30 W日光燈提供光照，光照度為1 500 lx。用空氣泵通入用0.22 μm濾膜過(guò)濾的無(wú)菌空氣，通氣量為300 mL/min，經(jīng)過(guò)10 d光照培養(yǎng)。

1.3　生長(zhǎng)曲線的制作和比生長(zhǎng)速率的測(cè)定

在葛仙米的生長(zhǎng)過(guò)程中，每隔1 d取1次藻液。培養(yǎng)液pH值為6.0、7.0、8.0的培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min 離心30 min，倒掉上清液，加入4 mL 95%乙醇，振蕩，4 ℃冰箱中避光放置24 h。4 000 r/min離心30 min，取上清液，用分光光度計(jì)分別測(cè)定665、649 nm波長(zhǎng)的吸光度D665 nm、D649 nm。根據(jù)以下公式計(jì)算葉綠素a(Chlorophyll a，Chla)含量(μg/mL)[12]：Chla=13.95×D665 nm-6.88×D649 nm。繪制時(shí)間(d)、葉綠素含量(μg/mL)的生長(zhǎng)曲線圖。比生長(zhǎng)速率μ的計(jì)算依據(jù)公式μ=(lnx1-lnx2)/(T2-T1)，其中x1和x2分別為培養(yǎng)后0、10 d的葉綠素a含量(μg/mL)，T1、T2分別為培養(yǎng)后0、10 d。

1.4　各種主要光合色素含量的測(cè)定

從培養(yǎng)10 d的葛仙米藻液中按照“1.2”節(jié)的方法取樣和提取色素，用分光光度計(jì)分別測(cè)定665、649、447 nm波長(zhǎng)的吸光度D665 nm、D649 nm、D470 nm。計(jì)算葉綠素a與類胡蘿卜素(carotenoids，Car)含量，其中Car含量的計(jì)算依據(jù)公式[12]：Car=1 000×D470 nm-2.05×Chl a。

從培養(yǎng)10 d的葛仙米藻液中各取20 mL的藻液，4 000 r/min 離心30 min，去上清液，各加入4 mL pH值為7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液，冰浴勻漿90次，4 000 r/min離心30 min。取上清液，用分光光度計(jì)分別測(cè)定上清液在562、615、652 nm波長(zhǎng)的吸光度D562 nm、D615 nm、D652 nm。計(jì)算藻藍(lán)蛋白(pycocyanin，PC)、別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)的含量。根據(jù)Siegelman等的公式[13]計(jì)算：PC(mg/mL)=(D615 nm-0.474×D652 nm)/5.34；APC(mg/mL)=(D652 nm-0.208×D615 nm)/5.09；PE(mg/mL)=(D562 nm-2.41×PC-0.849×APC)/9.62。

1.5　蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

從培養(yǎng)10 d的葛仙米藻液中各取20 mL的藻液，4 000 r/min 離心30 min，去上清液，各加入4 mL pH值為7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液，冰浴勻漿90次，4 000 r/min離心30 min。取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各樣品中蛋白質(zhì)的濃度[12]。

1.6　可溶性糖含量的測(cè)定

培養(yǎng)10 d的各瓶葛仙米藻液各取20 mL的藻液，4 000 r/min 離心30 min，去上清液，各加入4 mL蒸餾水，冰浴勻漿90次，4 000 r/min離心30 min。取上清液，蒽酮試劑法測(cè)定各樣品中可溶性糖濃度[13]。

1.7　統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)主要利用軟件STATISTICA?7.0(StatSoft Inc，Tulsa，OK，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。單因素方差分析(ANOVA)和Tukey’s顯著性檢驗(yàn)(HSD)用來(lái)檢測(cè)不同處理間的顯著性水平。Lilliefors檢驗(yàn)和Levene檢驗(yàn)分別用來(lái)檢驗(yàn)正態(tài)分布和方差同質(zhì)性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同pH值條件下葛仙米的生長(zhǎng)

研究顯示，葛仙米分別在6.0、7.0，8.0 pH值條件下培養(yǎng)10 d后，以葉綠素濃度表示的生物量分別增加到培養(yǎng)后0 d的6.61、9.21、7.47倍(圖1)。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，葛仙米的比生長(zhǎng)速率顯著高于其他2種不同pH值條件下葛仙米的比生長(zhǎng)速率(Tukey’s HSD，P<0.05)，pH值為8.0時(shí)葛仙米的生長(zhǎng)速率略高于pH值為6.0培養(yǎng)條件下葛仙米的比生長(zhǎng)速率，但2者之間無(wú)顯著差異(Tukey’s HSD，P>0.05) (表1)。

表1　在不同pH值葛仙米的比生長(zhǎng)速率

注：不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。表2、表3同。

2.2　不同pH值條件下葛仙米的光合色素含量的變化

研究顯示，pH值對(duì)葛仙米PC、APC、PE含量以及Chla含量、Car含量有不同影響(表2、表3)。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，葛仙米的各種光合色素的含量最高，pH值為8.0時(shí)的葛仙米各種光合色素的含量高于pH值為6.0時(shí)，且都有顯著差異(Tukey’s HSD，P<0.05)。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，葛仙米的PC、APC、PE、Chla、Car的含量分別為pH值為8.0和6.0時(shí)葛仙米的光合色素含量的1.37、1.57、1.41、1.12、1.18倍和2.14、3.12、2.30、1.32、1.34倍。

表2　不同pH值條件下葛仙米的PC、APC、PE的含量

表3　不同pH值條件下葛仙米的Chla和Car含量

2.3　不同條件下葛仙米的可溶性蛋白含量的變化

研究發(fā)現(xiàn)，pH值對(duì)葛仙米的可溶性蛋白含量有影響。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，葛仙米的可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于pH值為8.0、6.0時(shí)葛仙米的可溶性蛋白含量，分別是pH值為 8.0、6.0時(shí)的1.3、2.0倍。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，葛仙米的可溶性蛋白含量最高，pH值為8.0時(shí)葛仙米的可溶性蛋白含量高于pH值6.0時(shí)，且都有顯著差異(Tukey’s HSD，P<0.05，圖2)。

2.4　不同pH值條件下可溶性糖含量的變化

研究發(fā)現(xiàn)，pH值對(duì)葛仙米可溶性糖含量有影響(圖3)。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，葛仙米的可溶性糖含量顯著高于pH值為 8.0、6.0時(shí)葛仙米的可溶性糖含量。pH值為8.0時(shí)葛仙米的可溶性糖含量略高于pH值為6.0時(shí)葛仙米的可溶性糖含量，但兩者之間無(wú)顯著差異(Tukey’s HSD，P>0.05)。

3　結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)液中pH值為7.0時(shí)，培養(yǎng)10 d后以葉綠素含量表示的葛仙米生物量增長(zhǎng)幅度和比生長(zhǎng)速率最大，各種光合色素、可溶性糖及可溶性蛋白質(zhì)含量最高，當(dāng)培養(yǎng)液中的pH值為8.0時(shí)上述各項(xiàng)生理指標(biāo)高于培養(yǎng)液pH值為6.0時(shí)的上述各項(xiàng)生理指標(biāo)。因此，pH值為7.0的培養(yǎng)液比較適合貴州野生葛仙米的人工養(yǎng)殖。

劉繼勇對(duì)湖北省走馬鎮(zhèn)的葛仙米資源及葛仙米生長(zhǎng)的環(huán)境條件進(jìn)行調(diào)查研究，結(jié)果表明，適于葛仙米生長(zhǎng)的灌溉水源pH值為6.2～6.3[14]。但該研究并未調(diào)查葛仙米生長(zhǎng)水體的pH值，葛仙米生長(zhǎng)水體的pH值會(huì)受到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響，如農(nóng)業(yè)生產(chǎn)施肥以化肥為主的碳銨等肥料的使用會(huì)改變土壤及農(nóng)田水體的酸堿度[1]。程超等在葛仙米生長(zhǎng)及繁殖條件的探討的研究中以葛仙米的生長(zhǎng)曲線總結(jié)得出，葛仙米最適生長(zhǎng)pH值為6.0～7.5，pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響它的生長(zhǎng)及顏色[15]。在一定范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，葛仙米的顏色會(huì)加深，直至pH值升至7.5，但該研究沒(méi)有考慮葛仙米生長(zhǎng)過(guò)程中pH值的變化[15]。藻類的種群密度和生理代謝活動(dòng)都會(huì)影響水體的pH值，藻類生長(zhǎng)過(guò)程中水體的pH值是不斷發(fā)生變化的[9]。本研究通過(guò)pH值緩沖劑固定培養(yǎng)液的pH值，得到固定pH值條件下葛仙米的各項(xiàng)生理指標(biāo)。

溶解在水體中的HCO3-、CO32-、CO2都是藻類可以直接或間接吸收利用的無(wú)機(jī)碳形式。pH值會(huì)影響到培養(yǎng)液中CO2溶解度以及HCO3-、CO32-、CO2三者之間的解離平衡，進(jìn)而影響藻類對(duì)無(wú)機(jī)碳的吸收利用效率及光合作用速率[9]。CO2是藻類易于吸收的形式，pH值升高使水體中溶解的CO2含量降低而HCO3-含量升高。但pH值降低，水體中總無(wú)機(jī)碳含量降低[16]。鐵等微量金屬元素在藻類光合和呼吸等代謝過(guò)程中起重要作用，pH值還影響水體中Fe(OH)3、Fe2+、Fe3+之間的相互轉(zhuǎn)化，從而影響藻類對(duì)鐵的吸收利用[16]。因此，pH值為6.0時(shí)葛仙米的各項(xiàng)生理指標(biāo)較pH值為7.0時(shí)低，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)液中總無(wú)機(jī)碳濃度較低，影響了葛仙米的光合固碳。pH值為8.0時(shí)葛仙米的各項(xiàng)生理指標(biāo)也較pH值為7.0時(shí)低，可能是因?yàn)閜H值升高導(dǎo)致水體中可利用鐵含量降低。

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