李樂溪， 李　丹， 張　亮， 王軍娟， 楊緒勤， 蔣繼宏

(江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/江蘇省藥食植物生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)，江蘇徐州 221116)

植物內(nèi)生菌普遍存在于植物組織內(nèi)部，既能與宿主植物保持良好關(guān)系又不會(huì)引起宿主植物的病害，也不會(huì)改變宿主植物的表型特征和功能。內(nèi)生菌來自于宿主植物，并能在植物體內(nèi)發(fā)揮一系列生防功效。許多植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，而且具有多種生物活性，如殺菌、殺蟲、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化和促生長(zhǎng)等[1-2]。基于目前大量的研究，植物內(nèi)生菌顯示出了許多有益的生物學(xué)作用，因此植物內(nèi)生菌作為一種新興的微生物資源成為了國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

植物病害，尤其是由病原真菌引起的病害，一直是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中的棘手問題，給人類造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)期以來，人們認(rèn)為用化學(xué)農(nóng)藥解決植物病蟲害是最有效的辦法，但化學(xué)農(nóng)藥也會(huì)帶來許多危害。目前，人工合成的化學(xué)農(nóng)藥已有500余種，這些農(nóng)藥的廣泛使用，不僅造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，也對(duì)人類以及動(dòng)植物健康構(gòu)成危害。然而，利用植物內(nèi)生菌對(duì)植物病害進(jìn)行生物防治的研究已相當(dāng)普遍。何紅等從辣椒中分離篩選出2株內(nèi)生枯草芽孢桿菌，研究表明這2株菌對(duì)辣椒、白菜、香蕉等植物炭疽病具有良好的防治效果[3-5]；吳海燕等研究了大豆根瘤內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)大豆胞囊線蟲的抑制作用[6]；鄭愛萍等從水稻中分離獲得一株假單胞桿菌，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)水稻紋枯病有防治作用[7]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，研究開發(fā)生物農(nóng)藥防治植物病蟲害的呼聲日益高漲，因此，開發(fā)利用植物內(nèi)生菌的天然抗菌活性作為新型農(nóng)藥具有巨大的潛力。

大蒜(AlliumsativumL.)，為百合科蔥屬多年生草本縮根植物。大蒜不僅是生活中常見的調(diào)味品，也是一種非常重要的藥用植物。大蒜的鱗莖中富含豐富的蛋白質(zhì)、糖、維生素和礦物質(zhì)，不僅能增強(qiáng)食欲、促進(jìn)消化，而且根據(jù)研究表明，大蒜對(duì)多種細(xì)菌、真菌具有很強(qiáng)的殺傷、抑制作用，大蒜所含揮發(fā)性物質(zhì)、大蒜汁及大蒜素對(duì)多種危害人體健康的病原菌有拮抗作用[8]，因此，大蒜被譽(yù)為“天然廣譜殺菌劑”，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健價(jià)值，在各個(gè)方面有著廣泛應(yīng)用。本研究以10種采集自全國不同地區(qū)的新鮮大蒜為樣品進(jìn)行內(nèi)生菌分離，共分離得到102株大蒜內(nèi)生菌，通過抑菌活性試驗(yàn)，從中篩選出具有拮抗作用的菌株，通過革蘭氏染色試驗(yàn)、產(chǎn)生物被膜、淀粉酶活性和纖維素酶活性試驗(yàn)，以期獲得大蒜內(nèi)生菌的基本信息，為植物病蟲害的生物防治提供新的菌種資源。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1供試植物以10種采自江蘇徐州、山東金鄉(xiāng)、云南大理、湖南常德和甘肅隴南等不同地區(qū)的大蒜種植基地、農(nóng)民菜園的新鮮大蒜為樣品。

1.1.2目標(biāo)菌株茄鏈格孢(Alternariasolani)、辣椒枝孢(Cladosporiumcapsici)、稻梨孢菌(Pyriculariaoryzae)、白腐小核菌(sclerotiumcepivorum)、甘薯長(zhǎng)喙殼菌(Ceratocystisfimbriata)、古巴假霜霉菌(Pseudoperonosporacubensis)、尖孢鐮刀菌西瓜?；?Fusariumoxysporumf. sp.niveum)、蘋果輪紋病菌(Physalosporapiricola)、西瓜殼二孢(Ascochytacitrullina)。試驗(yàn)所用植物病原真菌均由江蘇師范大學(xué)江蘇省藥食植物生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)提供。

1.1.3培養(yǎng)基分離和純化培養(yǎng)基均采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)和ISP培養(yǎng)基2號(hào)(ISP2)。①PDA固體培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，去離子水1 L，瓊脂20 g，pH值自然。②LB固體培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸出粉5 g，去離子水 1 L，瓊脂20 g，pH值7.0～7.2。③ISP2固體培養(yǎng)基配方：葡萄糖4 g，酵母浸出粉4 g，麥芽浸膏粉10 g，瓊脂20 g，去離子水1 L，pH值7.0～7.2。④富集培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，配方：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸出粉5 g，去離子水1 L，pH值7.0～7.2。⑤淀粉酶檢測(cè)培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，硫酸鎂1 g，氯化鈉0.5 g，磷酸氫二鉀0.3 g，硝酸鉀1 g，瓊脂 20 g，去離子水1 L。⑥碘液的配制：碘片0.5 g，碘化鉀1 g，加入去離子水150 mL。⑦纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀0.3 g，硫酸鎂1 g，氯化鈉0.5 g，羧甲基纖維素鈉10 g，硝酸鉀1 g，酵母膏2 g，瓊脂20 g，去離子水1 L。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1大蒜內(nèi)生菌的分離將新鮮大蒜去皮，用去離子水超聲振蕩10 min。無菌環(huán)境下用次氯酸鈉溶液浸泡5 min，75%乙醇漂洗20 s，無菌生理鹽水沖洗2次，無菌水沖洗1次，對(duì)大蒜進(jìn)行表面消毒[9]。從最后一次沖洗的無菌水中吸取 100 μL 涂布在LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)1 d。證實(shí)無菌生長(zhǎng)，再進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。①組織切塊法：將經(jīng)過表面消毒的大蒜樣品在無菌環(huán)境下切成0.5 cm3的組織塊，均勻嵌插在PDA培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)7～10 d。②組織勻漿法[10]：取10 g表面消毒后的大蒜樣品與無菌水25 g混合，研磨成蒜汁，靜置15 min。吸取蒜汁進(jìn)行10倍梯度稀釋，得10-1、10-2、10-3濃度的組織液。分別從各梯度組織液中吸取 100 μL 涂布于PDA、LB、ISP2培養(yǎng)基上。PDA和ISP2平板放置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10 d，LB平板放置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10 d。分別從各分離平板上挑取菌落接種在新的純化培養(yǎng)基上，反復(fù)進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至獲得單一菌株并進(jìn)行常規(guī)保種備用。

1.2.2抑菌活性篩選采用平板對(duì)峙法對(duì)大蒜內(nèi)生菌的抑菌活性進(jìn)行篩選，具體操作如下：用0.5 cm打孔器分別將9種植物病原真菌制成菌餅，挑取1塊病原菌菌餅放置在PDA平板中心，在距離病原菌菌餅2.5 cm處的6個(gè)點(diǎn)接種不同大蒜內(nèi)生菌，另以不接種內(nèi)生菌的平板做對(duì)照。放置于28 ℃下培養(yǎng)5～7 d，記錄抑菌圈大小并測(cè)量抑菌圈半徑。抑制率計(jì)算公式為：抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑)×100%[11]。

1.2.316S rRNA的PCR擴(kuò)增[12]對(duì)篩選出的抑菌活性較高的菌株提取基因組DNA，采用16S rRNA全序列通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物測(cè)序后將16S rRNA全序列在https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網(wǎng)站中進(jìn)行Blast比對(duì)分析。系統(tǒng)發(fā)育樹采用Mega5軟件進(jìn)行構(gòu)建。

1.2.4拮抗菌的形態(tài)觀察及革蘭氏染色對(duì)篩選出的抑菌活性較好的菌株在LB培養(yǎng)基上采用四區(qū)劃線法劃出單菌落，記錄菌落的顏色、形狀等，通過顯微鏡觀察菌落特征。采用革蘭氏染色法[11]對(duì)有抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行染色觀察。

1.2.5產(chǎn)生物被膜能力檢測(cè)將所有待測(cè)菌株挑取至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)。將1%的待測(cè)菌液在無菌的加樣槽中與新的LB液體混合；在無菌環(huán)境下用排槍吸取100 μL加入96孔板中，每株菌做8個(gè)重復(fù)；將96孔板四周用封口膜封口，于30 ℃下培養(yǎng)(細(xì)菌培養(yǎng)24 h，放線菌培養(yǎng)4～5 d)；檢測(cè)96孔板里菌液的吸光度D600 nm值，判定菌株的生長(zhǎng)情況；將96孔板菌液倒掉，去離子水沖洗2遍；吸取 150 μL 結(jié)晶紫染液于96孔板中，染色15 min；用去離子水將染液沖洗干凈；200 μL 95%乙醇加入96孔板中，15 min后測(cè)定波長(zhǎng)595 nm下的吸光度D595 nm，通過D595 nm評(píng)估菌株產(chǎn)生物被膜的能力。

1.2.6淀粉酶活性檢測(cè)將待測(cè)菌株點(diǎn)植在檢測(cè)培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4～5 d。向平板內(nèi)加入碘液，使碘液剛好沒過培養(yǎng)基。10 min后傾倒碘液，用去離子水沖洗培養(yǎng)基表面進(jìn)行脫色。根據(jù)菌落周圍是否有透明圈判斷菌株產(chǎn)淀粉酶的能力，記錄透明圈與菌落直徑。

1.2.7纖維素酶活性檢測(cè)將大蒜內(nèi)生菌點(diǎn)植于檢測(cè)培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)4～5 d；向平板內(nèi)加入0.5%剛果紅溶液，使其沒過培養(yǎng)基。染色10 min后傾倒干凈。向平板加入NaCl溶液(1 mol/L)進(jìn)行脫色；觀察菌落四周有無透明圈產(chǎn)生，記錄透明圈與菌落直徑。

2　結(jié)果與分析

2.1　大蒜內(nèi)生菌的分離結(jié)果

根據(jù)菌株的菌落大小、顏色、型態(tài)等特征，挑取分離平板上的單菌落進(jìn)行純化，最終從10種來自不同地區(qū)的新鮮大蒜鱗莖中共分離得到細(xì)菌92株、真菌3株、放線菌7株(表1)。

表1　10個(gè)不同地區(qū)大蒜的內(nèi)生菌分離數(shù)量比較

2.2　大蒜內(nèi)生菌拮抗性分析

以茄鏈格孢、辣椒枝孢、大蒜白腐小核菌等9種植物病原真菌作為指示菌，對(duì)分離到的102株大蒜內(nèi)生菌進(jìn)行抑菌活性篩選(圖1)；通過16S rRNA對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行菌種鑒定，去除重復(fù)菌種后發(fā)現(xiàn)其中有19株內(nèi)生菌對(duì)至少5種病原真菌有拮抗作用，如表2所示：KLBMPGC05、KLBMPGC26、KLBMPGC31、KLBMPGC67、KLBMPGC73、KLBMPGC81、KLBMPGC90能同時(shí)抑制9種病原菌。其中，菌株KLBMPGC90的拮抗性最強(qiáng)，對(duì)白腐小核菌的抑菌率達(dá)到 90.24%，對(duì)其他病原菌的抑制率均在70%上下。

2.3　大蒜內(nèi)生菌的生理生化特征

對(duì)篩選出的19株大蒜內(nèi)生菌進(jìn)行革蘭氏染色、產(chǎn)生物被膜能力、淀粉酶活性和纖維素酶活性進(jìn)行檢測(cè)，染色結(jié)果用“+”代表革蘭氏陽性、“-”代表革蘭氏陰性。19株大蒜內(nèi)生菌產(chǎn)生物被膜、淀粉酶和纖維素酶的能力大小各不相同(表3、圖2、圖3)。

2.4　19株大蒜內(nèi)生菌的分子鑒定

根據(jù)聚類結(jié)果，將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送至北京博邁德科技發(fā)展有限公司進(jìn)行16S rRNA全序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果及其GenBank登錄號(hào)見表4。測(cè)序序列用Blast軟件與GenBank中已知的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)分析。選取若干同源性較高的參比菌株16S rRNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。

表2　內(nèi)生細(xì)菌對(duì)9種病原真菌的抑菌率

表3　大蒜內(nèi)生菌的生理生化特性

表4　供試菌株鑒定結(jié)果及其GenBank登錄號(hào)

3　結(jié)論與討論

本研究從采自10個(gè)不同地區(qū)、不同品種的大蒜蒜瓣中成功分離了大蒜內(nèi)生菌。其中，以內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量最多，說明細(xì)菌是大蒜內(nèi)生菌的優(yōu)勢(shì)菌，但大蒜中也存在真菌和放線菌這2種類型的菌。試驗(yàn)所分離得到的多數(shù)內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌對(duì)多種植物病原真菌具有廣譜抗性，且具有不同程度的產(chǎn)生物被膜能力和產(chǎn)酶能力。通過拮抗試驗(yàn)的篩選，未發(fā)現(xiàn)有拮抗效果的大蒜內(nèi)生真菌。

大蒜是人們喜愛的食品和調(diào)味品，是十分健康的食物，具有重要的保健意義。大蒜中含有眾多活性物質(zhì)，一直以來研究人員將大蒜素、蒜氨酸等物質(zhì)作為研究重點(diǎn)，在大蒜內(nèi)生菌的領(lǐng)域進(jìn)展較緩慢。人們自古以來就知道大蒜具有很強(qiáng)和廣譜的殺菌作用，有科學(xué)家試驗(yàn)用大蒜汁來抑制和殺滅幾種常見的污染食品的真菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蒜抑制腐敗真菌的強(qiáng)度高于一些化學(xué)防腐劑，是自然界中殺菌作用最強(qiáng)的植物。因此，基于內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與其宿主植物相類似的活性物質(zhì)，具有與宿主植物相類似的功能，且很多植物內(nèi)生細(xì)菌的抗菌活性普遍較高的理論[13-16]，本試驗(yàn)成功驗(yàn)證了大蒜內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌能同時(shí)抑制多種植物病原真菌的生長(zhǎng)。目前，在我國當(dāng)今社會(huì)對(duì)加強(qiáng)生物農(nóng)藥新產(chǎn)品研發(fā)、緩解農(nóng)藥殘留帶來的環(huán)境污染問題的呼聲越來越高，這種植物內(nèi)生菌“以菌治菌”的潛力將大大促進(jìn)生物農(nóng)藥的發(fā)展。我國自古以來就是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)業(yè)一直是國民經(jīng)濟(jì)的命脈。發(fā)展生物農(nóng)藥，以生物農(nóng)藥替代化學(xué)農(nóng)藥，不僅可以減少使用化學(xué)農(nóng)藥時(shí)所帶來的環(huán)境破壞和對(duì)人類身體健康的危害，也可為我國農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)創(chuàng)造十分有利的條件，極大地增強(qiáng)我國農(nóng)產(chǎn)品的國際競(jìng)爭(zhēng)力。由于在本試驗(yàn)中可以看到大蒜內(nèi)生菌具有較好的生防潛力[17]，下一步將通過更精確的篩選方法篩選出抑菌活性最強(qiáng)的菌株，進(jìn)行盆栽試驗(yàn)和大田試驗(yàn)，來研究這些大蒜拮抗內(nèi)生菌對(duì)植物病害的生防效果。

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