陶淑霞， 陸子慧

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118)

大豆食心蟲(chóng)(Leguminivoraglycinivorella)為單食性害蟲(chóng)，主要危害大豆，分布于我國(guó)東北、華北及山東等地，以東北三省危害嚴(yán)重，主要為幼蟲(chóng)蛀莢危害，常年蛀食率為10%～20%，嚴(yán)重時(shí)蛀食率為30%～40%，嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。初孵幼蟲(chóng)在豆莢上爬行數(shù)小時(shí)后，鉆入豆莢進(jìn)行危害，發(fā)育至老熟幼蟲(chóng)后脫莢，鉆入土中越冬，大豆食心蟲(chóng)的整個(gè)世代只有很短時(shí)間是暴露在外的，因此防治非常困難。目前，主要是在成蟲(chóng)發(fā)生盛期以菊酯類(lèi)藥劑防治大豆食心蟲(chóng)[2-3]。

球孢白僵菌(Beauveiabassiana)是害蟲(chóng)微生物防治中一種重要的蟲(chóng)生真菌，可侵染15個(gè)目的昆蟲(chóng)和一些螨類(lèi)，具有分布范圍廣、侵染力強(qiáng)、易于形成真菌流行病等特點(diǎn)，因此被認(rèn)為是具有開(kāi)發(fā)潛力的生防真菌[4-5]。球孢白僵菌不同菌株對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)的毒力存在著顯著差異[6-8]。

球孢白僵菌是大豆食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)的寄生性病原真菌，自然寄生率為5%～10%，是造成大豆食心蟲(chóng)自然死亡的主要因素之一[9]。為提高球孢白僵菌對(duì)大豆食心蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng)的防治效果，須要篩選對(duì)此蟲(chóng)具有高毒力的菌株。本研究采集自然球孢白僵菌菌株，并對(duì)其生物學(xué)性狀、毒力等指標(biāo)進(jìn)行比較研究，旨在篩選出生物學(xué)性狀優(yōu)良，且對(duì)大豆食心蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng)具有高毒力的菌株，以期為大豆食心蟲(chóng)的生防技術(shù)提供指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1　供試菌株及培養(yǎng)基

供試菌株分別采自吉林省長(zhǎng)春市、黑龍江省哈爾濱市和牡丹江地區(qū)的大豆食心蟲(chóng)越冬幼蟲(chóng)，采集后進(jìn)行分離與純化。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，簡(jiǎn)稱(chēng)PDA；配方為200 g馬鈴薯，30 g葡萄糖，20 g瓊脂，10 g酵母，1 000 mL 蒸餾水)。薩氏培養(yǎng)基(sabouraud dextrose agar with yeast extract，簡(jiǎn)稱(chēng)SDAY；配方為40 g葡萄糖，20 g瓊脂，10 g酵母，10 g蛋白胨，1 000 mL蒸餾水)。薩氏液體培養(yǎng)基(sabouraud dextrose with yeast extract，簡(jiǎn)稱(chēng)SDY；配方為40 g葡萄糖，10 g酵母，10 g蛋白胨，1 000 mL蒸餾水)。供試菌株的寄主昆蟲(chóng)及采集地點(diǎn)如表1所示。

1.2　供試?yán)ハx(chóng)

在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆中心收集自然脫莢的大豆食心蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng)，選取發(fā)育整齊一致的幼蟲(chóng)作為供試?yán)ハx(chóng)。

1.3　菌落生長(zhǎng)性狀觀察

分別取各分離菌株平板上的孢子粉，配制濃度為1.0×107個(gè)/mL的孢子懸浮液。取5 μL孢子懸浮液接在含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，重復(fù)3次，于25 ℃條件下培養(yǎng)，觀察并記錄各菌株菌落的形態(tài)，在第14天時(shí)測(cè)量各菌株菌落的直徑。

表1　供試菌株的寄主昆蟲(chóng)和采集地點(diǎn)

1.4　產(chǎn)孢量測(cè)定

在各菌株培養(yǎng)至第14天時(shí)，用打孔器(直徑為10 mm)在菌落半徑1/2處打孔取菌塊，每個(gè)菌株重復(fù)3次，將菌塊置于三角瓶中，加入20 mL 0.05%吐溫-80溶液，充分?jǐn)嚢璧玫芥咦討腋∫?，利用血球?jì)數(shù)板對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。

1.5　孢子萌發(fā)率測(cè)定

分別取各菌株平板培養(yǎng)的分生孢子適量，加入20 mL SDY培養(yǎng)基中，配制濃度為1.0×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，在25 ℃，130 r/min條件下培養(yǎng)24 h后，吸取20 μL菌液滴在血球計(jì)數(shù)板上，置于顯微鏡下，觀察并記錄孢子的萌發(fā)情況，芽管長(zhǎng)度大于或等于孢子直徑的孢子視為萌發(fā)[10]。

1.6　胞外蛋白酶含量測(cè)定

平板由質(zhì)量體積比為1.0%的明膠和質(zhì)量體積比為 1.5% 的瓊脂配成。各菌株分別配制成濃度為1×108個(gè)/mL孢子懸浮液，各取10 μL滴于平板中心，每個(gè)菌株重復(fù)3次，于25 ℃條件下培養(yǎng)4 d后，將15%的HgCl2溶液倒入平板。在垂直2個(gè)方向分別測(cè)量透明環(huán)直徑和菌落直徑，以兩者比值作為胞外蛋白酶產(chǎn)酶量的指示值。

1.7　毒力測(cè)定

1.7.1菌土的制備選取生物學(xué)性狀良好的3個(gè)菌株(Cc-2、Cc-3、Mdj-3)用于毒力測(cè)定。將3個(gè)菌株的孢子懸浮液均勻涂在SDAY培養(yǎng)皿中，于25 ℃條件下培養(yǎng)10 d，取 0.5 mg 孢子粉，加入50 mL 0.05%吐溫-80溶液中，配制成孢子懸浮液，在顯微鏡下測(cè)定該孢子懸浮液的濃度，計(jì)算出1 g孢子粉所含的孢子數(shù)。稱(chēng)取孢子粉與滅菌土(過(guò)50目篩)充分混勻，配制成含孢子數(shù)為1.0×107個(gè)/g的菌土，備用。

1.7.2測(cè)定方法取滅過(guò)菌的土壤并將其配制成含水量為20%的土壤，盛于塑料杯(8 cm×12 cm)中，然后在表面均勻?yàn)⑸吓渲频木?以未施用菌土為CK)，每杯接入20頭供試?yán)ハx(chóng)，待幼蟲(chóng)入土后，置于溫度為25 ℃條件下培養(yǎng)，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，在接種后第4、6、8、10天進(jìn)行調(diào)查，計(jì)算不同時(shí)間的死亡率、校正死亡率、侵染率和致死中時(shí)(median lethal time，簡(jiǎn)稱(chēng)LT50)。

1.8　數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn)各菌株生物學(xué)性狀及其對(duì)大豆食心蟲(chóng)毒力的差異顯著性(P<0.05)，用回歸分析的Probit分析供試菌株對(duì)大豆食心蟲(chóng)的致死中時(shí)(LT50)。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同菌株菌落形態(tài)分析

在PDA培養(yǎng)基上不同菌株的菌落形態(tài)存在較大的差異。由表2可知，菌株Cc-2、Cc-3、Mdj-1、Mdj-3和Heb-1均屬薄粉狀菌落，孢子層厚且產(chǎn)孢早；菌株Cc-1屬絨毛狀菌落，即菌絲生長(zhǎng)速度快，但產(chǎn)孢量少；菌株Mdj-2、Heb-2均屬氈狀菌落，產(chǎn)孢量介于薄粉狀和絨毛狀之間。

表2　各菌株在培養(yǎng)基上的形態(tài)特征

2.2　不同菌株生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率的比較分析

由表3可知，不同菌株的生長(zhǎng)速度存在顯著差異(F7，23=218.09，P<0.000 1)。菌株Cc-1營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)最快，第14天時(shí)菌落直徑達(dá)61.66 mm，其次是菌株Cc-3、Mdj-3、Cc-2，菌落直徑分別為59.36、54.18、52.14 mm，菌株Heb-2營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)最慢，第14天時(shí)菌落直徑為28.36 mm。各菌株的產(chǎn)孢量差異顯著(F7，23=40.77，P<0.000 1)。菌株Cc-2、Cc-3和Mdj-3的產(chǎn)孢量較大，分別為1.26×108、1.14×108、1.32×108個(gè)/mL，菌株Cc-1的產(chǎn)孢量最低，為0.27×108個(gè)/mL。各菌株的萌發(fā)率也存在顯著差異(F7，23=11.03，P<0.000 1)，菌株Cc-2、Cc-3和Mdj-3的萌發(fā)率較高，分別為96.01%、93.74%、95.17%。

表3　各菌株菌落直徑、產(chǎn)孢量及萌發(fā)率

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著。下表同。

2.3　不同菌株的胞外蛋白酶活性比較分析

由圖1可知，培養(yǎng)96 h后各菌株胞外蛋白酶產(chǎn)生水平有顯著差異(F7，23=15.13，P<0.000 1)。菌株Cc-2和 Mdj-3 產(chǎn)酶量較高，產(chǎn)酶水平分別為2.03、1.88，兩者差異不顯著；其次是菌株Cc-3，產(chǎn)酶水平為1.57，其他菌株的胞外蛋白酶產(chǎn)酶量較低。

2.4　不同菌株對(duì)大豆食心蟲(chóng)的毒力分析

在上述研究的基礎(chǔ)上，決定選取生物學(xué)性狀優(yōu)良的菌株Cc-2、Cc-3和Mdj-3進(jìn)行致病力測(cè)定。由表4可知，不同菌株之間對(duì)大豆食心蟲(chóng)的校正死亡率(F2，8=22.05，P=0.002)和侵染率(F2，8=38.71，P<0.000 1)有顯著差異，其中菌株Cc-2對(duì)大豆食心蟲(chóng)毒力最強(qiáng)，施藥后第10天校正死亡率高達(dá)92.55%，侵染率為90.00%，致死中時(shí)LT50為 6.54 d。

表4　不同菌株對(duì)大豆食心蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng)的毒力分析

3　討論

不同來(lái)源的球孢白僵菌具有明顯的寄主專(zhuān)化性[11]。姚劍等通過(guò)測(cè)定球孢白僵菌對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)(Dendrolimuspunctatus)和淡色庫(kù)蚊(Culexpipienspallens)的毒力，確定不能用球孢白僵菌對(duì)淡色庫(kù)蚊的毒力測(cè)定來(lái)代替對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)的毒力測(cè)定，驗(yàn)證了其寄主專(zhuān)化性的存在[12]?？梢?jiàn)，應(yīng)用白僵菌防治害蟲(chóng)最重要的是篩選對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)致病力強(qiáng)的菌株。

劉玉軍等篩選了對(duì)櫟旋木柄天牛(Aphrodisiumsauteri)高致病力Bb202菌株，該菌株產(chǎn)孢能力強(qiáng)且孢子萌發(fā)速度快[6]。張海劍等通過(guò)測(cè)定不同球孢白僵菌菌株對(duì)二點(diǎn)委夜蛾(Athetislepigone)的毒力，篩選出毒力較強(qiáng)的Ed-41菌株，該菌株具有生長(zhǎng)快、孢子萌發(fā)速率高、產(chǎn)孢量大等優(yōu)良性狀[7]。結(jié)果表明，對(duì)大豆食心蟲(chóng)高致病力的菌株具有良好的生物學(xué)性狀，可見(jiàn)，球孢白僵菌的生物學(xué)指標(biāo)與菌株的致病力具有明顯的相關(guān)性。

蟲(chóng)生真菌的蛋白降解酶能夠分解寄主昆蟲(chóng)體壁中的蛋白質(zhì)，有利于真菌穿透寄主體壁形成侵染[13-14]。馮明光發(fā)現(xiàn)，不同球孢白僵菌菌株胞外蛋白酶的產(chǎn)生量與供試?yán)ハx(chóng)的死亡率呈顯著正相關(guān)關(guān)系[15]。結(jié)果表明，對(duì)大豆食心蟲(chóng)致病力強(qiáng)的菌株，其胞外蛋白酶的產(chǎn)生水平也較高。本研究中篩選的Cc-2菌株具有營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)快、孢子萌發(fā)率高、產(chǎn)孢能力強(qiáng)且對(duì)大豆食心蟲(chóng)具有高毒力的特點(diǎn)，可作為防治大豆食心蟲(chóng)的生防菌株。

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