陶淑霞, 陸子慧
(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118)
大豆食心蟲(chóng)(Leguminivoraglycinivorella)為單食性害蟲(chóng),主要危害大豆,分布于我國(guó)東北、華北及山東等地,以東北三省危害嚴(yán)重,主要為幼蟲(chóng)蛀莢危害,常年蛀食率為10%~20%,嚴(yán)重時(shí)蛀食率為30%~40%,嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。初孵幼蟲(chóng)在豆莢上爬行數(shù)小時(shí)后,鉆入豆莢進(jìn)行危害,發(fā)育至老熟幼蟲(chóng)后脫莢,鉆入土中越冬,大豆食心蟲(chóng)的整個(gè)世代只有很短時(shí)間是暴露在外的,因此防治非常困難。目前,主要是在成蟲(chóng)發(fā)生盛期以菊酯類(lèi)藥劑防治大豆食心蟲(chóng)[2-3]。
球孢白僵菌(Beauveiabassiana)是害蟲(chóng)微生物防治中一種重要的蟲(chóng)生真菌,可侵染15個(gè)目的昆蟲(chóng)和一些螨類(lèi),具有分布范圍廣、侵染力強(qiáng)、易于形成真菌流行病等特點(diǎn),因此被認(rèn)為是具有開(kāi)發(fā)潛力的生防真菌[4-5]。球孢白僵菌不同菌株對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)的毒力存在著顯著差異[6-8]。
球孢白僵菌是大豆食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)的寄生性病原真菌,自然寄生率為5%~10%,是造成大豆食心蟲(chóng)自然死亡的主要因素之一[9]。為提高球孢白僵菌對(duì)大豆食心蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng)的防治效果,須要篩選對(duì)此蟲(chóng)具有高毒力的菌株。本研究采集自然球孢白僵菌菌株,并對(duì)其生物學(xué)性狀、毒力等指標(biāo)進(jìn)行比較研究,旨在篩選出生物學(xué)性狀優(yōu)良,且對(duì)大豆食心蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng)具有高毒力的菌株,以期為大豆食心蟲(chóng)的生防技術(shù)提供指導(dǎo)。
供試菌株分別采自吉林省長(zhǎng)春市、黑龍江省哈爾濱市和牡丹江地區(qū)的大豆食心蟲(chóng)越冬幼蟲(chóng),采集后進(jìn)行分離與純化。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,簡(jiǎn)稱(chēng)PDA;配方為200 g馬鈴薯,30 g葡萄糖,20 g瓊脂,10 g酵母,1 000 mL 蒸餾水)。薩氏培養(yǎng)基(sabouraud dextrose agar with yeast extract,簡(jiǎn)稱(chēng)SDAY;配方為40 g葡萄糖,20 g瓊脂,10 g酵母,10 g蛋白胨,1 000 mL蒸餾水)。薩氏液體培養(yǎng)基(sabouraud dextrose with yeast extract,簡(jiǎn)稱(chēng)SDY;配方為40 g葡萄糖,10 g酵母,10 g蛋白胨,1 000 mL蒸餾水)。供試菌株的寄主昆蟲(chóng)及采集地點(diǎn)如表1所示。
在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆中心收集自然脫莢的大豆食心蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng),選取發(fā)育整齊一致的幼蟲(chóng)作為供試?yán)ハx(chóng)。
分別取各分離菌株平板上的孢子粉,配制濃度為1.0×107個(gè)/mL的孢子懸浮液。取5 μL孢子懸浮液接在含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,重復(fù)3次,于25 ℃條件下培養(yǎng),觀察并記錄各菌株菌落的形態(tài),在第14天時(shí)測(cè)量各菌株菌落的直徑。
表1 供試菌株的寄主昆蟲(chóng)和采集地點(diǎn)
在各菌株培養(yǎng)至第14天時(shí),用打孔器(直徑為10 mm)在菌落半徑1/2處打孔取菌塊,每個(gè)菌株重復(fù)3次,將菌塊置于三角瓶中,加入20 mL 0.05%吐溫-80溶液,充分?jǐn)嚢璧玫芥咦討腋∫?,利用血球?jì)數(shù)板對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。
分別取各菌株平板培養(yǎng)的分生孢子適量,加入20 mL SDY培養(yǎng)基中,配制濃度為1.0×106個(gè)/mL的孢子懸浮液,在25 ℃,130 r/min條件下培養(yǎng)24 h后,吸取20 μL菌液滴在血球計(jì)數(shù)板上,置于顯微鏡下,觀察并記錄孢子的萌發(fā)情況,芽管長(zhǎng)度大于或等于孢子直徑的孢子視為萌發(fā)[10]。
平板由質(zhì)量體積比為1.0%的明膠和質(zhì)量體積比為 1.5% 的瓊脂配成。各菌株分別配制成濃度為1×108個(gè)/mL孢子懸浮液,各取10 μL滴于平板中心,每個(gè)菌株重復(fù)3次,于25 ℃條件下培養(yǎng)4 d后,將15%的HgCl2溶液倒入平板。在垂直2個(gè)方向分別測(cè)量透明環(huán)直徑和菌落直徑,以兩者比值作為胞外蛋白酶產(chǎn)酶量的指示值。
1.7.1菌土的制備選取生物學(xué)性狀良好的3個(gè)菌株(Cc-2、Cc-3、Mdj-3)用于毒力測(cè)定。將3個(gè)菌株的孢子懸浮液均勻涂在SDAY培養(yǎng)皿中,于25 ℃條件下培養(yǎng)10 d,取 0.5 mg 孢子粉,加入50 mL 0.05%吐溫-80溶液中,配制成孢子懸浮液,在顯微鏡下測(cè)定該孢子懸浮液的濃度,計(jì)算出1 g孢子粉所含的孢子數(shù)。稱(chēng)取孢子粉與滅菌土(過(guò)50目篩)充分混勻,配制成含孢子數(shù)為1.0×107個(gè)/g的菌土,備用。
1.7.2測(cè)定方法取滅過(guò)菌的土壤并將其配制成含水量為20%的土壤,盛于塑料杯(8 cm×12 cm)中,然后在表面均勻?yàn)⑸吓渲频木?以未施用菌土為CK),每杯接入20頭供試?yán)ハx(chóng),待幼蟲(chóng)入土后,置于溫度為25 ℃條件下培養(yǎng),每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù),在接種后第4、6、8、10天進(jìn)行調(diào)查,計(jì)算不同時(shí)間的死亡率、校正死亡率、侵染率和致死中時(shí)(median lethal time,簡(jiǎn)稱(chēng)LT50)。
采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn)各菌株生物學(xué)性狀及其對(duì)大豆食心蟲(chóng)毒力的差異顯著性(P<0.05),用回歸分析的Probit分析供試菌株對(duì)大豆食心蟲(chóng)的致死中時(shí)(LT50)。
在PDA培養(yǎng)基上不同菌株的菌落形態(tài)存在較大的差異。由表2可知,菌株Cc-2、Cc-3、Mdj-1、Mdj-3和Heb-1均屬薄粉狀菌落,孢子層厚且產(chǎn)孢早;菌株Cc-1屬絨毛狀菌落,即菌絲生長(zhǎng)速度快,但產(chǎn)孢量少;菌株Mdj-2、Heb-2均屬氈狀菌落,產(chǎn)孢量介于薄粉狀和絨毛狀之間。
表2 各菌株在培養(yǎng)基上的形態(tài)特征
由表3可知,不同菌株的生長(zhǎng)速度存在顯著差異(F7,23=218.09,P<0.000 1)。菌株Cc-1營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)最快,第14天時(shí)菌落直徑達(dá)61.66 mm,其次是菌株Cc-3、Mdj-3、Cc-2,菌落直徑分別為59.36、54.18、52.14 mm,菌株Heb-2營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)最慢,第14天時(shí)菌落直徑為28.36 mm。各菌株的產(chǎn)孢量差異顯著(F7,23=40.77,P<0.000 1)。菌株Cc-2、Cc-3和Mdj-3的產(chǎn)孢量較大,分別為1.26×108、1.14×108、1.32×108個(gè)/mL,菌株Cc-1的產(chǎn)孢量最低,為0.27×108個(gè)/mL。各菌株的萌發(fā)率也存在顯著差異(F7,23=11.03,P<0.000 1),菌株Cc-2、Cc-3和Mdj-3的萌發(fā)率較高,分別為96.01%、93.74%、95.17%。
表3 各菌株菌落直徑、產(chǎn)孢量及萌發(fā)率
注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著。下表同。
由圖1可知,培養(yǎng)96 h后各菌株胞外蛋白酶產(chǎn)生水平有顯著差異(F7,23=15.13,P<0.000 1)。菌株Cc-2和 Mdj-3 產(chǎn)酶量較高,產(chǎn)酶水平分別為2.03、1.88,兩者差異不顯著;其次是菌株Cc-3,產(chǎn)酶水平為1.57,其他菌株的胞外蛋白酶產(chǎn)酶量較低。
在上述研究的基礎(chǔ)上,決定選取生物學(xué)性狀優(yōu)良的菌株Cc-2、Cc-3和Mdj-3進(jìn)行致病力測(cè)定。由表4可知,不同菌株之間對(duì)大豆食心蟲(chóng)的校正死亡率(F2,8=22.05,P=0.002)和侵染率(F2,8=38.71,P<0.000 1)有顯著差異,其中菌株Cc-2對(duì)大豆食心蟲(chóng)毒力最強(qiáng),施藥后第10天校正死亡率高達(dá)92.55%,侵染率為90.00%,致死中時(shí)LT50為 6.54 d。
表4 不同菌株對(duì)大豆食心蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng)的毒力分析
不同來(lái)源的球孢白僵菌具有明顯的寄主專(zhuān)化性[11]。姚劍等通過(guò)測(cè)定球孢白僵菌對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)(Dendrolimuspunctatus)和淡色庫(kù)蚊(Culexpipienspallens)的毒力,確定不能用球孢白僵菌對(duì)淡色庫(kù)蚊的毒力測(cè)定來(lái)代替對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)的毒力測(cè)定,驗(yàn)證了其寄主專(zhuān)化性的存在[12]??梢?jiàn),應(yīng)用白僵菌防治害蟲(chóng)最重要的是篩選對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)致病力強(qiáng)的菌株。
劉玉軍等篩選了對(duì)櫟旋木柄天牛(Aphrodisiumsauteri)高致病力Bb202菌株,該菌株產(chǎn)孢能力強(qiáng)且孢子萌發(fā)速度快[6]。張海劍等通過(guò)測(cè)定不同球孢白僵菌菌株對(duì)二點(diǎn)委夜蛾(Athetislepigone)的毒力,篩選出毒力較強(qiáng)的Ed-41菌株,該菌株具有生長(zhǎng)快、孢子萌發(fā)速率高、產(chǎn)孢量大等優(yōu)良性狀[7]。結(jié)果表明,對(duì)大豆食心蟲(chóng)高致病力的菌株具有良好的生物學(xué)性狀,可見(jiàn),球孢白僵菌的生物學(xué)指標(biāo)與菌株的致病力具有明顯的相關(guān)性。
蟲(chóng)生真菌的蛋白降解酶能夠分解寄主昆蟲(chóng)體壁中的蛋白質(zhì),有利于真菌穿透寄主體壁形成侵染[13-14]。馮明光發(fā)現(xiàn),不同球孢白僵菌菌株胞外蛋白酶的產(chǎn)生量與供試?yán)ハx(chóng)的死亡率呈顯著正相關(guān)關(guān)系[15]。結(jié)果表明,對(duì)大豆食心蟲(chóng)致病力強(qiáng)的菌株,其胞外蛋白酶的產(chǎn)生水平也較高。本研究中篩選的Cc-2菌株具有營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)快、孢子萌發(fā)率高、產(chǎn)孢能力強(qiáng)且對(duì)大豆食心蟲(chóng)具有高毒力的特點(diǎn),可作為防治大豆食心蟲(chóng)的生防菌株。
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