陳切希， 簡志青， 賈冬英， 遲原龍， 姚　開

(1.四川大學輕紡與食品學院，四川成都 610065； 2.元智大學生物工程與科技研究所，臺灣桃園 32003)

近年來，隨著人類對農產品的需求量不斷增大，農藥的使用量也呈不斷上升趨勢，然而長期使用造成了農畜產品和土壤中農藥的殘留量超標。β-氯氰菊酯是一種重要的擬除蟲菊酯類農藥，廣泛施用可能導致環(huán)境中殘留量超標，直接或間接對人類健康造成威脅[1-2]。微生物降解法具有安全、環(huán)保、無二次污染等特點被廣泛應用于農產品以及土壤中農藥的降解。目前，具有轉化效率高的微生物已被應用于環(huán)境或農作物土壤中殘留農藥的降解[3]，然而多數菌株只能將β-氯氰菊酯(β-CY)降解為3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)[4]。原生質體融合技術是工業(yè)上微生物育種的一種重要手段，可以在種間、屬間以及跨界融合[5]。原生質體制備和再生是其融合過程非常關鍵的環(huán)節(jié)，直接決定育種的效率[6]。筆者所在實驗室前期從污染土壤中分離到地衣芽孢桿菌B-1和鞘氨醇單胞菌SC-1，前者可以將β-CY降解為3-PBA，后者可以將 3-PBA 繼續(xù)降解[7]。吳雙研究表明，制備的菌株B-1和菌株SC-1可濕性粉劑可以修復β-CY污染的土壤，有效降低小白菜中β-CY殘留[8]。本研究探討了地衣芽孢桿菌 B-1 和鞘氨醇單胞菌SC-1的原生質體制備和再生條件，以期為通過原生質體融合技術選育β-CY和3-PBA高效降解菌奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

地衣芽孢桿菌B-1(BacilluslicheniformisB-1)為實驗室前期從茶園土壤分離馴化并保存的菌種，適宜條件下對β-CY 降解率為94.12%。鞘氨醇單胞菌SC-1(Sphingomonassp. SC-1)為筆者所在實驗室前期從農藥廠排污渠下游土壤中分離并保存的菌種，可以礦化降解 3-PBA。

β-CY原藥(含量96.8%，榮城化工公司)，3-PBA標準品(純度>98%，梯希愛化成工業(yè)有限公司)，溶菌酶(100 000 U/mg，Sigma公司)，酸水解酪蛋白、胰蛋白胨、酵母膏、瓊脂(BD公司)，蔗糖、葡萄糖、順丁烯二酸、琥珀酸鈉、甘露醇、青霉素、甘氨酸、BSA(Sigma公司)，其他試劑均為國產分析純。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5.0 g，NaCl 10 g，去離子水1 000 mL，pH值7.0，吐溫80 2.0 mL，121 ℃滅菌 20 min；LB瓊脂培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入瓊脂18 g和定量β-CY 或3-PBA工作液，使其濃度為100 mg/L，121 ℃滅菌20 min；再生培養(yǎng)基DM3：參照文獻[9]制備，用于菌株B-1原生質體的再生；再生培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5.0 g，NaCl 10 g，蔗糖171 g，去離子水1 000 mL，pH值7.0，吐溫80 2.0 mL，121 ℃滅菌20 min，用于菌株SC-1原生質體再生；原生質體穩(wěn)定液(SMM)：0.5 mol/L蔗糖，0.02 mol/L MgCl2，0.02 mol/L順丁烯二酸，pH值6.5，121 ℃滅菌20 min；Tris-HCl緩沖液：Tris-HCl 0.01 mol/L，pH值8.0，121 ℃滅菌 20 min；EDTA溶液：EDTA 0.1 mol/L，用KOH溶液調pH值至 8.0，121 ℃滅菌20 min；溶菌酶液：用SMM溶液分別配制溶菌酶濃度為2.0 mg/mL和10 mg/mL溶液，0.22 μm膜過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SP-830 PLUS可見光分光光度計(Metertech公司)，UB-10 精密酸度計(Denver公司)，Axiostar Plus光學顯微鏡(Zeiss公司)，CF16RXII高速冷凍離心機(Hitachi公司)。

1.2　試驗方法

1.2.1菌株B-1和菌株SC-1生長曲線繪制將菌株 B-1 和菌株SC-1分別劃線接種于β-CY或3-PBA濃度為100 mg/L的LB瓊脂斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，無菌生理鹽水洗下菌苔，混勻，按5.0%體積比例接入β-CY或 3-PBA 濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基，30 ℃振蕩(180 r/min)培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，測其吸光度D600 nm，以培養(yǎng)時間對D600 nm作圖。

1.2.2菌株B-1原生質體的制備和再生按5.0%的體積比例將菌株B-1接入β-CY濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩(180 r/min)培養(yǎng)至對數生長期。SMM洗滌菌體2次，離心(4 ℃，8 000 r/min)10 min，SMM重懸并調其D600 nm為1.2，取少量適當稀釋后涂布于LB平板，30 ℃培養(yǎng) 24～48 h，菌落數記為A；余下的菌懸液中加入不同濃度的溶菌酶液，37 ℃振蕩(100 r/min)30 min，離心(4 ℃，4 000 r/min)10 min，沉淀重懸于SMM，涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基DM3，30 ℃培養(yǎng)24～48 h，菌落數分別記為B(未被除壁的菌體細胞)和C(再生菌體細胞)，按下式計算菌株B-1原生質體的形成率和再生率[10]：

形成率=(A-B)/A×100%；

再生率=(C-B)/(A-B)×100%。

1.2.3菌株SC-1原生質體的制備和再生按5.0%的體積比例將菌株SC-1接種于3-PBA濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基，30 ℃振蕩(180 r/min)培養(yǎng)至對數生長期。Tris-HCl緩沖液洗滌菌體2次，離心(4 ℃，12 000 r/min)10 min，Tris-HCl緩沖液重懸并調D600 nm為1.4，加入EDTA溶液，使其終濃度為10 mmol/L，37 ℃振蕩(100 r/min)20 min。SMM洗滌菌體2次，重懸于SMM，加入溶菌酶溶液，37 ℃振蕩(100 r/min)15 min，離心(4 ℃，4 000 r/min)10 min，沉淀重懸于SMM[11，12]。SMM梯度稀釋，涂布于再生培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)96～120 h。菌株SC-1原生質體的形成率和再生率計算方法同“1.3.2”節(jié)。

1.2.4影響菌株原生質體形成和再生的因素

1.2.4.1甘氨酸和青霉素對原生質體形成和再生的影響分別在菌株B-1和菌株SC-1生長延滯期加入甘氨酸(終濃度為1.0 mg/mL)或在生長對數期中期加入青霉素(終濃度為2.5 U/mL)，測定并計算原生質體的形成率和再生率。

1.2.4.2溶菌酶濃度對原生質體形成和再生的影響當菌株B-1生長至對數末期時(13 h)，分別用不同濃度的溶菌酶作用15 min；當菌株SC-1生長至對數末期(12 h)時，EDTA預處理，分別用不同濃度的溶菌酶作用20 min；測定并計算原生質體的形成率和再生率。

1.2.4.3溶菌酶作用時間對原生質體形成和再生的影響用溶菌酶分別對菌株 B-1 和菌株SC-1作用不同時間，測定原生質體的形成率和再生率。

1.2.4.4EDTA濃度對原生質體形成和再生的影響分別用不同濃度的EDTA溶液對菌株SC-1進行預處理，測定并計算原生質體形成率與再生率。

1.2.4.5穩(wěn)定劑對原生質體形成和再生的影響考察相同濃度(0.5 mol/L)穩(wěn)定劑(琥珀酸鈉、蔗糖、氯化鈉、甘露醇)的再生培養(yǎng)基分別對菌株B-1和菌株SC-1再生率的影響。

1.2.4.6原生質體制備和再生適宜條件的確定基于上述單因素試驗結果，對原生質體制備和再生的適宜條件進行試驗確認。

1.3　數據處理

所有試驗平行重復3次，使用軟件Origin 9.0和Excel 2017對試驗數據進行分析處理。

2　結果與分析

2.1　菌株B-1和菌株SC-1的生長曲線

菌株B-1和菌株SC-1的生長曲線如圖1和圖2所示。可以看出，菌株B-1的延滯期為8 h，16 h后進入穩(wěn)定期；菌株SC-1經過2 h的延滯期進入對數生長期，18 h后進入穩(wěn)定期。對數期菌體的生理狀態(tài)相對一致，代謝旺盛，對溶菌酶的敏感性強，有利于原生質體形成和再生，對數期末菌體數最多，方便收集[13]，因此菌株B-1和菌株SC-1菌齡分別是13 h和12 h。

2.2　影響原生質體形成和再生的因素

2.2.1甘氨酸和青霉素對原生質體形成和再生的影響甘氨酸是細菌細胞壁的結構類似物，可能摻入細胞壁中，擾亂肽聚糖的相互交聯(lián)，導致細胞壁結構的不完整，不利于細胞的生長[13]。青霉素可能與轉肽酶結合，抑制其側鏈末端的丙氨酸與五肽橋的連接，影響轉肽作用與肽鍵的形成，所以增強菌體對溶菌酶的敏感性，有利于細胞原生質體的形成[14]。表1結果表明，2個菌株的培養(yǎng)過程中分別加入甘氨酸或青霉素的原生質體形成率雖然略有提高，但是原生質體的再生率顯著降低。

表1　甘氨酸和青霉素對菌株原生質體形成和再生的影響

2.2.2溶菌酶濃度對原生質體形成和再生的影響由圖3可以看出，2個菌株原生質體形成率均隨溶菌酶濃度的增加而提高，而再生率呈下降趨勢；當溶菌酶濃度為0.1 mg/mL 時，菌株B-1的原生質體形成率(90%)和再生率(4.61%)較高；當溶菌酶濃度為3.33 mg/mL時，菌株SC-1的形成率(90.2%)和再生率(13.73%)較高；當酶濃度繼續(xù)增加，2個菌株的原生質體形成率提高不明顯， 但原生質體再生率顯著下降。因為溶菌酶酶解細胞壁的原因是它可以破壞細胞壁肽聚糖的β-1，4糖苷鍵，濃度越高破壞效果越明顯，易導致脫壁過度，使其失去再生細胞壁的引物[13-14]，所以當其濃度過高時，再生率顯著降低。

2.2.3溶菌酶作用時間對原生質體形成和再生的影響由圖4可以看出，初始階段菌株B-1和菌株SC-1原生質體形成率隨作用時間的延長迅速提高，15 min后提高緩慢，而再生率隨作用時間的延長而降低。溶菌酶作用時間短，原生質體表面的細胞壁碎片較多，可作為細胞壁再生的引物，但作用時間過長，菌體細胞壁碎片被全部酶解，而且原生質體容易受損，導致其再生困難[15]。

2.2.4EDTA濃度對原生質體形成和再生的影響由圖5可以看出，隨著EDTA濃度增加，菌株SC-1的原生質體形成率提高，而再生率呈現下降趨勢。以原生質體形成率與再生率的乘積最大作為判斷原生質體制備條件的依據[16]，EDTA預處理的適宜濃度為5 mmol/L。EDTA對菌株SC-1進行預處理可明顯提高原生質體的形成率，因為EDTA可以通過螯合作用破壞菌株SC-1細胞壁的外膜，有利于溶菌酶與肽聚糖的接觸，提高原生質體的形成率，但是EDTA對原生質體具有毒害作用，隨著作用時間延長，原生質體的再生率下降[11]。

2.2.5穩(wěn)定劑對原生質體形成和再生的影響由表2可以看出，琥珀酸鈉是菌株B-1原生質體再生的較理想穩(wěn)定劑，其再生率(6.82%)最高；蔗糖是菌株SC-1原生質體再生的較理想穩(wěn)定劑，再生率(26.54%)最高。穩(wěn)定劑一方面可以調節(jié)滲透壓維持原生質體的穩(wěn)定有利于再生，另一方面原生質體可能會利用穩(wěn)定劑代謝產酸，導致再生培養(yǎng)基的pH值下降，不利于原生質體的再生，選擇合適的穩(wěn)定劑對原生質體的再生至關重要。

2.2.6原生質體制備適宜條件的驗證基于單因素試驗結果，確定菌株B-1原生質體制備的適宜條件為：菌齡13 h，溶菌酶濃度0.1 mg/mL，溶菌酶作用時間15 min；菌株SC-1原生質體制備的適宜條件為：菌齡12 h，EDTA濃度 5 mmol/L，溶菌酶濃度3.33 mg/mL，溶菌酶作用時間15 min。驗證試驗結果顯示，菌株B-1原生質體形成率為93.11%，再生率為7.22%；菌株SC-1原生質體形成率為95.37%，再生率為27.04%。2個菌株原生質體制備前后的顯微鏡圖像如圖6和圖7所示?？梢钥闯?，長桿狀的菌株B-1細胞和短桿狀的菌株SC-1細胞多數轉變?yōu)榍蛐巍?/p>

表2　穩(wěn)定劑對菌株B-1和菌株SC-1原生質體再生的影響

3　結論

原生質體制備是原生質體融合的關鍵技術之一，要制備有活性且大量的原生質體，需要對不同菌株進行合適的處理。本研究對分離得到的地衣芽孢桿菌B-1和鞘氨醇單胞菌 SC-1 原生質體進行研究，發(fā)現菌齡、溶菌酶濃度及作用時間等因素對原生質體的形成和再生影響明顯。本研究獲得了具有活性的原生質體，適宜條件下菌株B-1和菌株SC-1的原生質體形成率和再生率均較高，為后續(xù)通過原生質體融合技術選育β-CY高效降解菌奠定了基礎。

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