楊衛(wèi)軍， 呂有軍，，3， 趙蘭杰， 張永山

(1.安陽(yáng)工學(xué)院，河南安陽(yáng) 455000； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽(yáng) 455000；3.棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽(yáng) 455000)

WOX(WUSCHEL-related homeobox)基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[1-3]。該家族蛋白含有1段能夠與DNA序列特異結(jié)合的由60～66個(gè)氨基酸組成的同源異型結(jié)構(gòu)域(home domain，簡(jiǎn)稱HD)，具有調(diào)控植物干細(xì)胞分裂分化、胚發(fā)育、側(cè)生器官發(fā)育、頂端分生組織分化和花器官形成等多種重要功能[4-8]。

不同植物中WOX基因的生物學(xué)功能不同，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中各自扮演著重要的角色。目前已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)擬南芥基因組中存在15個(gè)WOX，各個(gè)WOX成員在擬南芥中的功能不同[9]。AtWUS基因與莖尖頂端分生組織發(fā)育相關(guān)，同時(shí)也參與花藥和子房發(fā)育過(guò)程[10-12]；AtWOX3基因調(diào)控?cái)M南芥花瓣的發(fā)育[13]，AtWOX13和AtWOX14基因除了參與擬南芥花器官發(fā)育外，還影響擬南芥根發(fā)育[14]；AtWOX11和AtWOX12基因共同參與外植體根器官發(fā)育[15]。水稻基因組中OsWOX1是參與調(diào)控不定根生長(zhǎng)發(fā)育的主要基因，對(duì)激活冠狀根的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用[16]。此外，在玉米、茄子、番茄、楊樹和高粱等植物中也有關(guān)于WOX基因的報(bào)道[9，17-18]。棉花是世界上一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)歷多個(gè)階段。迄今為止，棉花WOX基因在棉花生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能未知。本研究以中69-11165為試驗(yàn)材料，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(簡(jiǎn)稱RT-PCR)技術(shù)克隆GhWOX4基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從基因及蛋白結(jié)構(gòu)、序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹等方面分析該基因的結(jié)構(gòu)和功能，為進(jìn)一步揭示W(wǎng)OX轉(zhuǎn)錄因子在棉花生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1植物材料陸地棉(GossypiumhirsutumL.)中69-11165由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所中熟課題組提供，種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場(chǎng)試驗(yàn)站。從田間植株摘取葉片，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于RNA提取。

1.1.2試劑材料RNA提取使用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒；焦碳酸二乙酯(DEPC)水、氨芐青霉素(AMP)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)大腸桿菌(Escherichiacoli)Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell、KOD-Plus-Neo、pEASY-Blunt Cloning Kit載體、Maker Ⅲ購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。引物和DNA測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司合成及完成。

1.2　方法

RNA提取采用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒，采用ND1000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定D260 nm和D280 nm，計(jì)算RNA濃度與純度。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。按照轉(zhuǎn)錄酶TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說(shuō)明書合成cDNA的第1鏈。

1.2.1棉花GhWOX4基因克隆用擬南芥AtWOX4(AT1G46480)蛋白序列作為探針，在四倍體陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.cottongen.org)中通過(guò)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)了4個(gè)相似性較高的基因Gh_D05G1962、Gh_A05G1768、Gh_D01G1055 和Gh_A01G0998。由于這些基因在棉花中的功能未知，筆者選取其中1個(gè)基因Gh_D01G1055作為研究對(duì)象，用Primer3設(shè)計(jì)擴(kuò)增開放閱讀框的引物(表1)。以棉花葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

表1　引物序列

表2　PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)，回收并純化后連接至Peasy-Blunt Cloning Kit載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，搖菌，將鑒定正確的質(zhì)粒送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.2GhWOX4基因序列的生物信息學(xué)分析用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；用在線HNN軟件(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)在線預(yù)測(cè)和分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成形式；用EBL-EBI (http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)和NCBI的BlastP分析氨基酸序列的蛋白質(zhì)保守區(qū)；用IBS 1.0軟件繪制蛋白結(jié)構(gòu)域圖；用SignaIP和WOLF PSORT(http：//psort.hgc.jp/)進(jìn)行信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位分析；用DNAMAN和Clustal X進(jìn)行多重序列比對(duì)及同源性比對(duì)；用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

2　結(jié)果與分析

2.1　陸地棉GhWOX4基因克隆及序列分析

以擬南芥AtWOX4(AT1G46480)蛋白序列作為探針，在四倍體陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.cottongen.org)中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)相似性較高的基因Gh_D05G1962、Gh_A05G1768、Gh_D01G1055 和Gh_A01G0998。由于這些基因在棉花中的功能未知，筆者選取其中1個(gè)基因Gh_D01G1055作為研究對(duì)象，其基因組序列全長(zhǎng)為1 962 bp，包含長(zhǎng)度為654 bp的開放閱讀框(ORF)，以中69-11165棉纖維cDNA為模板，用特異引物GhWOX4F和GhWOX4R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得1條600 bp左右的目的條帶(圖1)?；厥漳康钠?，測(cè)序結(jié)果分析顯示擴(kuò)增獲得的cDNA序列包含長(zhǎng)度為657 bp的開放閱讀框，編碼218個(gè)氨基酸，與陸地棉Gh_D01G1055序列相似性為99.27%，氨基酸序列一致性為72.40%，表明陸地棉不同種間核酸序列存在一些差異。鑒于棉花中WOX基因尚未見(jiàn)到相關(guān)研究報(bào)道，將其命名為GhWOX4(NCBI登錄號(hào)為KX900572)。

2.2　GhWOX4基因編碼蛋白生物信息學(xué)分析

從GhWOX4基因cDNA序列推測(cè)GhWOX4蛋白包含218個(gè)氨基酸殘基，用ProtParam預(yù)測(cè)GhWOX4蛋白的基本理化性質(zhì)。結(jié)果表明，GhWOX4蛋白分子式為C1119H1 762N336O311S9，理論分子量為25.19 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為10.04，酸性氨基酸(Asp+Glu)有19個(gè)，堿性氨基酸(Arg+Lys)有36個(gè)；含量最豐富的氨基酸有Leu(9.2%)、Lys(9.2%)和Gly(8.3%)；脂肪系數(shù)為63.99，總平均親水性為0.913，不穩(wěn)定系數(shù)為58.61，為不穩(wěn)定蛋白。采用HNN在線預(yù)測(cè)分析GhWOX4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，該蛋白主要由α-螺旋、延伸直鏈和無(wú)規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)形式構(gòu)成，其中α-螺旋包含71個(gè)氨基酸，約占32.57%，延伸直鏈包含28個(gè)氨基酸，約占12.84%，無(wú)規(guī)則卷曲包含119個(gè)氨基酸，約占39.86%。可見(jiàn)，無(wú)規(guī)則卷曲是該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分。

為了進(jìn)一步確定GhWOX4基因是否屬于WOX家族，用EBL-EBI在線分析，結(jié)合NCBI 中的BlastP比對(duì)，對(duì)該基因氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)保守區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)GhWOX4基因具有1個(gè)同源異型HD(第74位至第147位氨基酸)結(jié)構(gòu)域，該基因?qū)儆诘湫偷腤OX家族成員，其位置如圖2所示。采用SignaIP分析GhWOX4蛋白信號(hào)肽并預(yù)測(cè)信號(hào)肽位點(diǎn)表明，其平均分小于0.500，最大Y值預(yù)測(cè)表明GhWOX4蛋白不存在信號(hào)肽及切割位點(diǎn)，屬于非分泌蛋白(圖3)。由WOLF PSORT軟件在線預(yù)測(cè)該蛋白的亞細(xì)胞定位情況表明，GhWOX4蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)和過(guò)氧化物酶體上，在線粒體基質(zhì)中有少量分布。

2.3　GhWOX4蛋白多重序列比對(duì)和蛋白進(jìn)化樹分析

為了解棉花GhWOX4蛋白與其他植物WOX蛋白的親緣關(guān)系，用DNAMAN軟件將GhWOX4氨基酸序列與NCBI上公布的其他植物的WOX蛋白進(jìn)行多重序列比較，結(jié)果表明棉花GhWOX4與GenBank中桑樹、番茄等植物的蛋白序列相似性均較低，與擬南芥和可可樹相似性較高，與陸地棉 Gh_D01G1055 氨基酸序列相似性最高，其同源區(qū)域主要集中在同源異型HD結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步確定該基因?qū)儆赪OX家族成員，如圖4所示?；诿藁℅hWOX4及其他植物WOX基因蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析結(jié)果表明，棉花GhWOX4基因同陸地棉Gh_D01G1055基因、擬南芥AtWOX4基因、可可樹TcWOX4基因、番茄SlWOX4基因等在同一個(gè)進(jìn)化分支上，屬于WOX4亞家族，如圖5所示。

3　結(jié)論與討論

與其他植物相比，棉花中大多數(shù)的WOX基因仍未被克隆及研究，本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆了陸地棉中1個(gè)WOX基因GhWOX4。氨基酸序列分析和蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，GhWOX4基因含有典型的HD同源異型結(jié)構(gòu)域，并且與擬南芥AtWOX4基因、可可樹TcWOX4基因等具有很高的序列同源性，因此屬于WOX基因家族。

系統(tǒng)樹分析表明，GhWOX4基因?qū)儆赪OX基因家族的Ⅰ類亞家族成員，與陸地棉中Gh_D01G1055蛋白、擬南芥AtWOX4、可可樹TcWOX4、番茄SlWOX4等在同一個(gè)進(jìn)化分支上。有研究表明，擬南芥AtWOX4基因在維管束形成層和原形成層表達(dá)，促進(jìn)形成層和原形成層分化，影響植物的次生生長(zhǎng)[19]。沉默OsWOX4后，水稻莖尖分生組織發(fā)育異常，植株矮小，株型異常，葉片失綠發(fā)黃[20]。OsWOX4除了參與維管束發(fā)育，在花的分生組織和花序中也有很高的表達(dá)水平[20]。番茄中過(guò)表達(dá)SlWOX4，其篩管和導(dǎo)管數(shù)量明顯增多[21]。經(jīng)高溫脅迫處理后番茄通過(guò)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制了SlWOX4的表達(dá)水平，表明番茄可能通過(guò)調(diào)節(jié)SlWOX4在器官組織中的表達(dá)水平來(lái)調(diào)控其發(fā)育進(jìn)程來(lái)響應(yīng)高溫干旱環(huán)境[18]。

通過(guò)其他植物WOX4基因功能研究發(fā)現(xiàn)，WOX4不僅參與維管束及花器官發(fā)育，同時(shí)對(duì)逆境脅迫具有一定的應(yīng)答機(jī)制。本研究表明，GhWOX4基因?qū)儆赪OX轉(zhuǎn)錄因子家族，具體功能有待利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行進(jìn)一步分析驗(yàn)證，最終為闡明WOX轉(zhuǎn)錄因子在棉花生長(zhǎng)發(fā)育中的功能和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Laux T，Mayer K F，Berger J，et al. TheWUSCHELgene is required for shoot and floral meristem integrity inArabidopsis[J]. Development，1996，122(1)：87-96.

[2]Haecker A，Grosshardt R，Geiges B，et al. Expression dynamics ofWOXgenes mark cell fate decisions during early embryonic patterning inArabidopsisthaliana[J]. Development，2004，131(3)：657-668.

[3]van der Graaff E，Laux T，Rensing S A. The WUS homeobox-containing (WOX) protein family[J]. Genome Biology，2009，10(12)：248.

[4]王占軍，陳金慧，施季森. 植物干細(xì)胞中WUS/CLV反饋調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 林業(yè)科學(xué)，2011，47(4)：159-165.

[5]Yadav R K，Reddy G V. WUSCHEL protein movement and stem cell homeostasis[J]. Plant Signaling & Behavior，2012，7(5)：592-594.

[6]高麗，孫祎敏，邵鐵梅，等. 植物WUSCHEL-related homeobox(WOX)家族研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2015，34(5)：7-12.

[7]王俞程，何瑞萍，彭獻(xiàn)軍，等. WOX轉(zhuǎn)錄因子家族研究進(jìn)展[J]. 草業(yè)科學(xué)，2015，32(5)：760-769.

[8]Ueda M，Zhang Z，Laux T，et al. Transcriptional activation ofArabidopsisaxis patterning genesWOX8/9 links zygote polarity to embryo development[J]. Developmental Cell，2011，20(2)：264-270.

[9]Zhang X，Zong J，Liu J，et al. Genome-wide analysis ofWOXgene family in rice，sorghum，maize，Arabidopsisand poplar[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2010，52(11)：1016-1026.

[10]Gross-Hardt R，Lenhard M，Laux T. WUSCHEL signaling functions in interregional communication duringArabidopsisovule development[J]. Genes & Development，2002，16(9)：1129-1138.

[11]Deyhle F，Sarkar A K，Tucker E J，et al.WUSCHELregulates cell differentiation during anther development[J]. Developmental Biology，2007，302(1)：154-159.

[12]Gallois J L，Nora F R，Mizukami Y，et al.WUSCHELinduces shoot stem cell activity and developmental plasticity in the root meristem[J]. Genes & Development，2004，18(4)：375-380.

[13]Vandenbussche M，Horstman A，Zethof J，et al. Differential recruitment ofWOXtranscription factors for lateral development and organ fusion in petunia andArabidopsis[J]. Plant Cell，2009，21(8)：2269-2283.

[14]Deveaux Y，Toffano-Nioche C，Claisse G，et al. Genes of the most conserved WOX clade in plants affect root and flower development inArabidopsis[J]. BMC Evolutionary Biology，2008，8(1)：291.

[15]Liu J C，Sheng L H，Xu Y Q，et al.WOX11 and 12 are involved in the first-step cell fate transition during de novo root organogenesis inArabidopsis[J]. The Plant Cell，2014，26(3)：1081-1093.

[16]Zhao Y，Hu Y F，Dai M Q，et al. The WUSCHEL-related homeobox geneWOX11 is required to activate shoot-borne crown root development in rice[J]. The Plant Cell，2009，21(3)：736-748.

[17]韓洪強(qiáng)，劉楊，周子路，等. 茄子SmWOX13基因的克隆、亞細(xì)胞定位及序列分析[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2015，33(2)：1-8，17.

[18]李曉旭，劉成，李偉，等. 番茄WOX轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定及其進(jìn)化、表達(dá)分析[J]. 期刊名稱缺失，2016，38(5)：444-460.

[19]Hirakawa Y，Kondo Y，F(xiàn)ukuda H. TDIF peptide signaling regulates vascular stem cell proliferation via theWOX4 homeobox gene inArabidopsis[J]. The Plant Cell，2010，22(8)：2618-2629.

[20]Ohmori Y，Tanaka W，Kojima M，et al.WUSCHEL-RELATEDHOMEOBOX4 is involved in meristem maintenance and is negatively regulated by the CLE geneFCP1 in rice[J]. The Plant Cell，2013，25(1)：229-241.

[21]Ji J B，Strable J，Shimizu R，et al.WOX4 promotes procambial development[J]. Plant Physiology，2010，152(3)：1346-1356.