邱超　鄭亞妮　許碩貴

周圍神經(jīng)損傷是臨床常見疾患，隨著神經(jīng)橋接和自體神經(jīng)移植等方法的應(yīng)用，其修復(fù)取得了一定進展，但損傷后的功能恢復(fù)仍不盡如人意。其中，影響神經(jīng)再生和功能修復(fù)的主要因素是神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)段施旺細(xì)胞支持神經(jīng)再生的能力，故圍繞促進施旺細(xì)胞再生及存活的研究，成為周圍神經(jīng)損傷修復(fù)研究的熱點問題。

間充質(zhì)干細(xì)胞 （Mesenchymal stem cells，MSCs）具有自我更新和多向分化能力，是臨床細(xì)胞治療中極具吸引力的干細(xì)胞資源，可由骨髓、脂肪、臍血和其他成體組織分離獲得[1-2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，MSC植入后可治療神經(jīng)損傷和退化[3-5]。其中，BMSCs發(fā)現(xiàn)較早，具有來源豐厚、獲取簡單、增殖力強等諸多優(yōu)點，是常用的神經(jīng)組織工程種子細(xì)胞[6]。本研究采用SD大鼠來源的BMSCs，將其植入大鼠坐骨神經(jīng)損傷處，觀察其對神經(jīng)損傷后施旺細(xì)胞的影響。

1　材料和方法

1.1　實驗動物和材料

雄性SD大鼠，3周齡2只，體質(zhì)量40～50 g；6周齡9只，體質(zhì)量180～200 g（第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心）。DMEM/F12培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）和 1%青霉素/鏈霉素（美國Gibco公司）；小鼠抗S100β抗體 （美國Abcam公司）；山羊抗小鼠IgG二抗 （美國Invitrogen公司）；DAPI和RIPA（武漢谷歌生物科技有限公司）。

1.2　大鼠BMSCs的分離和培養(yǎng)

將2只3周齡SD大鼠經(jīng)脫臼處死后，置于75%乙醇中消毒5 min，取雙側(cè)股骨，15 m L PBS沖洗骨髓腔，收集沖洗液，并用70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，將濾液移至15 m L離心管中，1 500 r/min離心5 min，用培養(yǎng)基（DMEM/F12+10%FBS+1%青霉素/鏈霉素）重懸后種植于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后全換液，PBS沖洗3次，去除未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達80%融合時，按1∶2傳代，傳至第4代后備用。

1.3　坐骨神經(jīng)橫斷損傷模型的制備

9只6周齡SD大鼠，其中3只為正常組，僅分籠正常飼養(yǎng)即可。其余6只腹腔麻醉后，暴露坐骨神經(jīng)，在距坐骨結(jié)節(jié)遠(yuǎn)側(cè)4 mm處切斷，神經(jīng)斷端曠置，將肌肉和皮膚縫合。2周后即成為神經(jīng)損傷模型。術(shù)后常規(guī)抗感染治療，正常分籠飼養(yǎng)。

1.4　BMSCs移植

將損傷模型分為BMSCs組和PBS組，每組3只，損傷2周后進行細(xì)胞移植。腹腔麻醉，暴露橫斷損傷后的坐骨神經(jīng)。BMSCs組用10μL的 Hamilton微量注射器，向損傷神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)段注入BMSCs，細(xì)胞濃度2×105cells/μL，總量 3 μL，分 3點注入。 PBS 組，即對照組，同法注入等量PBS。然后縫合肌肉和皮膚，術(shù)后進行抗感染治療，正常分籠飼養(yǎng)，6周后取材。

1.5　HE染色和免疫熒光染色

將厚度為5μm的坐骨神經(jīng)石蠟切片，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，鏡下觀察拍照。

坐骨神經(jīng)石蠟切片 （5μm厚），4%多聚甲醛固定 10 min，PBS清洗 3遍，0.3%Triton-X-100打孔10 min，5%驢血清封閉 20 min，孵育一抗（S-100β，1∶400），4℃過夜， 二抗室溫孵育1.5 h，PBS清洗3遍，每次 5 min，DAPI染核 5 min，PBS 清洗 3 遍，每次5 min?？篃晒獯銣鐒┓馄?，熒光顯微鏡下觀察。

1.6　統(tǒng)計學(xué)處理

以SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　BMSCs形態(tài)特征

BMSCs呈典型長梭形貼壁生長，兩端有較長突起，胞核為卵圓形，均勻分布。細(xì)胞從原代（圖1A）至第4代形態(tài)變化不明顯（圖1B）。我們的前期實驗已對同樣方法獲得的細(xì)胞進行了鑒定，其對于CD44、CD90的表達高達90%，而CD34、CD45的表達則為陰性，證實其為BMSCs[7]。

圖1　BMSCs的形態(tài)特征（標(biāo)尺=100μm）Fig.1　Morphology of BMSCs(Scale bar=100μm)

2.2　HE染色觀察

HE染色可見正常坐骨神經(jīng)軸突及雪旺細(xì)胞排列整齊，施旺細(xì)胞完整且結(jié)構(gòu)清晰，并間斷形成有規(guī)律的迂曲（圖2 A）。坐骨神經(jīng)損傷后有些軸突腫脹、軸突及雪旺細(xì)胞破潰、排列雜亂；BMSCs組相較于PBS組，施旺細(xì)胞數(shù)量明顯較多，且排列較均勻，連接較緊密（圖2 C）；PBS組細(xì)胞排列稀疏，分布混亂（圖 2 B）。

圖2　損傷坐骨神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)段HE染色觀察（標(biāo)尺=50μm）Fig.2　Morphological observation of the distal of injured sciatic nerve by HE staining(Scale bar=50μm)

2.3　免疫熒光染色觀察

結(jié)果顯示，縱切面（圖3 A-C）施旺細(xì)胞在正常坐骨神經(jīng)組織中，平行有序致密排列。而損傷后的組織中，施旺細(xì)胞數(shù)量變少，且出現(xiàn)破碎和中斷，排列間隙變大。與PBS組相比，BMSC s組的細(xì)胞結(jié)構(gòu)更清晰，細(xì)胞數(shù)量更多，細(xì)胞完整度更高。橫切面上（圖3 D-F）正常神經(jīng)的施旺細(xì)胞呈圓形，排列均勻。PBS組細(xì)胞破碎，出現(xiàn)大量零星的S-100β的表達，而在BMSC組中，完整的施旺細(xì)胞數(shù)量顯著增多 （圖3 G），與正常組的施旺細(xì)胞形態(tài)更為接近。實驗結(jié)果提示，植入的BMSCs能促進施旺細(xì)胞的存活或再生，促進細(xì)胞生成更規(guī)則和完整的形態(tài)。

圖3　損傷坐骨神遠(yuǎn)側(cè)段免疫熒光染色觀察（A-C：標(biāo)尺=10μm；D-F：標(biāo)尺=25μm）Fig.3　Morphological observation of the distal of injured sciatic nerve by immunofluorescence staining(A-C:Scale bars=10μm;D-E:Scale bars=25μm)

3　討論

周圍神經(jīng)再生速度很慢，過程復(fù)雜，影響其再生和功能修復(fù)的主要因素涉及3個方面：神經(jīng)元的再生能力；損傷神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)段施旺細(xì)胞支持神經(jīng)再生的能力；靶器官接受神經(jīng)再支配能力。而其中導(dǎo)致神經(jīng)再生受阻的主要原因是損傷神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)段施旺細(xì)胞對神經(jīng)再生的支持[8-9]。

神經(jīng)損傷后，其遠(yuǎn)側(cè)段失神經(jīng)施旺細(xì)胞基因表達迅速發(fā)生改變，細(xì)胞表型由髓鞘型轉(zhuǎn)變?yōu)樯L支持型。施旺細(xì)胞開始分裂、增殖，并在1周時達到高峰，增殖的施旺細(xì)胞在基膜內(nèi)形成Büngner帶，為再生軸突提供營養(yǎng)支持和物理保護功能[10-11]。如果長期得不到近側(cè)段軸突的再接觸，施旺細(xì)胞會萎縮、塌陷和凋亡。施旺細(xì)胞上調(diào)炎性因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子以及黏附分子的表達，同時會募集巨噬細(xì)胞于損傷處，以清除損傷軸突及髓鞘殘骸，為軸突再生提供合適的微環(huán)境[10]。軸突再生后，施旺細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樗枨市?，包繞軸突形成髓鞘，支持后期神經(jīng)功能的恢復(fù)[12]。神經(jīng)末端的施旺細(xì)胞引導(dǎo)再生軸突方向，使其準(zhǔn)確找到靶器官。施旺細(xì)胞通過以上多種方式支持周圍神經(jīng)的再生和功能恢復(fù)。

基于損傷遠(yuǎn)側(cè)段失神經(jīng)施旺細(xì)胞是維持神經(jīng)再生的關(guān)鍵因素，施旺細(xì)胞替代治療和組織工程的研究成為周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的熱點問題[13-15]。有研究將施旺細(xì)胞或?qū)⒏杉?xì)胞植入體內(nèi)，觀察移植后軸突再生和功能恢復(fù)情況[16-17]。但是，卻少有報道觀察干細(xì)胞植入后對宿主施旺細(xì)胞的保護及促再生作用。本實驗重點觀察BMSCs移植后施旺細(xì)胞的變化，探究其是否對宿主施旺細(xì)胞有保護和促進再生的作用，以進一步探討干細(xì)胞促進周圍神經(jīng)再生的作用機制。

本實驗檢測了損傷區(qū)域BMSCs對施旺細(xì)胞的保護和再生作用，BMSC s組相較于PBS組有更好的細(xì)胞形態(tài)和更多的細(xì)胞數(shù)量，而且HE染色也同時觀察到神經(jīng)纖維的排列更加整齊有序，神經(jīng)恢復(fù)情況更好。在免疫熒光染色中，可見PBS組中施旺細(xì)胞大多破碎分布不均，而BMSC組中完整細(xì)胞數(shù)量更多，結(jié)構(gòu)更加清晰。說明BMSCs細(xì)胞的接觸對長期失神經(jīng)的施旺細(xì)胞有保護功能，使其維持正常細(xì)胞形態(tài)，在損傷8周后，施旺細(xì)胞依然能夠保持其正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)并發(fā)揮其支持神經(jīng)再生的功能。

上述結(jié)果說明，BMSCs植入坐骨神經(jīng)后除了有替代功能外，還可以通過保護施旺細(xì)胞，進而促進周圍神經(jīng)的再生和功能恢復(fù)。

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