程燕詠　王佳怡　蔣云鳳　孫宇

七氟烷是最常用的吸入麻醉藥，具有代謝率高、起效快、恢復快等特點。然而，大量的研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷暴露與嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)副作用有關，如大腦結構異常、認知功能障礙、異常行為、自閉癥等[1-3]。我們早先的研究也驗證了長時間七氟烷暴露，能使發(fā)育期及成年大鼠產(chǎn)生認知功能障礙[4-5]，猜測可能是激活了凋亡途徑進而產(chǎn)生神經(jīng)毒性[6]，然而其具體機制尚未被闡明。

最近的研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）可以通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、趨化因子和細胞因子，產(chǎn)生強大的神經(jīng)保護作用[7-10]。注射BMSCs可改善鼠類缺血再灌注誘導的神經(jīng)損傷[11]。臨床試驗表明，基于間充質(zhì)干細胞的治療是安全有效的[12-13]。但尚無研究證實BMSCs是否能改善七氟烷導致的神經(jīng)毒性損傷。

本實驗嘗試應用BMSCs預處理干預七氟烷對原代神經(jīng)元的凋亡和細胞活性產(chǎn)生的影響，探索BMSCs在緩解神經(jīng)毒性損傷中起的作用；并通過檢測培養(yǎng)液上清中的炎癥因子TNFα水平，探索BMSCs通過抗炎、抗免疫失調(diào)機制產(chǎn)生神經(jīng)保護作用的可能性，為防治七氟烷造成的神經(jīng)毒性損傷提供新的思路。

1　材料和方法

1.1　主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、Neuron-basal培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國）；多聚賴氨酸（Sigma公司， 美國）；caspase-3 抗體、β-actin 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；電轉(zhuǎn)液、電泳液 （生工生物工程有限公司）；MTT檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒 （南京建成科技有限公司）；ELISA檢測試劑盒（聯(lián)科生物技術股份有限公司）。

超凈工作臺、細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisher公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；超敏化學發(fā)光成像系統(tǒng)（GE公司，美國）；多功能酶標儀（BioTek公司，美國）。

1.2　細胞培養(yǎng)

1.2.1原代神經(jīng)元的分離培養(yǎng)

50μg/mL的多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿，37℃過夜，吸除賴氨酸，PBS清洗晾干后備用。取出生24 h內(nèi)的SD乳鼠 （中科院上海生命科學研究院提供），處死后75%乙醇消毒，無菌條件下將頭部剪下，置于盛有預冷DMEM高糖培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。分離出大腦，仔細剝除軟腦膜和血管后，快速將腦組織移入另一盛有預冷DMEM高糖培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，將腦組織剪成大小約1 mm3的碎塊，加入0.25%胰蛋白酶，置于37℃培養(yǎng)箱中消化25 min后取出。終止消化后移入離心管，反復輕輕吹打使其成為細胞懸液，1 500 r/min離心10 min，棄上清。重懸靜置后篩網(wǎng)過濾，再次離心棄上清，加接種培養(yǎng)液對細胞重懸后靜置，以5×105cells/mL的細胞密度接種于多聚賴氨酸包被的細胞培養(yǎng)皿中。置于37℃培養(yǎng)箱中，4 h后換成含2%B27的Neuron-basal培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第3天進行半換液，第5天開始BMSC預處理。倒置相差顯微鏡下觀察原代神經(jīng)元的生長情況。

1.2.2BMSC的分離培養(yǎng)

取6 d齡雄性SD大鼠（上海第九人民醫(yī)院動物實驗中心提供），脫頸處死后75%乙醇消毒，無菌條件下取股骨，用5 mL DMEM低糖完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 mg/mL青、鏈霉素）沖洗骨髓腔。沖洗得到的細胞懸液接種于6 cm培養(yǎng)皿。48～72 h半換液，之后每3天換液1次。細胞生長融合至80%～90%后，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第3代細胞備用。

1.3　BMSC預處理及七氟烷暴露

BMSC的預處理以運用Transwell（24孔，0.4μm孔徑，Costar）構建非接觸性共培養(yǎng)體系的形式完成。以是否接受BMSCs預處理（BMSCs+/BMSCs-）和是否接受七氟烷暴露（SEV+/SEV-）為標準，分為4組。①SEV-BMSCs-組：原代神經(jīng)元在孔下部，DMEM低糖完全培養(yǎng)基在膜上；②SEV-BMSCs+組：原代神經(jīng)元在孔下部，200 μL BMSCs（1×105cells/mL）在膜上；③SEV+BMSCs-組：原代神經(jīng)元在孔下部，DMEM低糖完全培養(yǎng)基在膜上；④SEV+BMSCs+組：原代神經(jīng)元在孔下部，200 μL BMSCs（1×105cells/mL）在膜上。BMSCs預處理在正常培養(yǎng)箱中維持24 h。結束后，4組的上層小室均被取走，下層的培養(yǎng)基也均被更換。③④組隨即進行七氟烷暴露 （4%七氟烷暴露6 h）。①②組繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后各組同時結束，取樣檢測。

1.4　Western Blot檢測細胞凋亡

細胞蛋白的抽提和定量按照說明書操作。蛋白樣品每次使用前煮沸5 min。配置12%凝膠，80 V恒壓電泳至染料剛出膠底部，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。膜在5%脫脂奶粉中封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3遍后加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3遍后顯色。以Image J軟件統(tǒng)計灰度值。

1.5　MTT檢測細胞活性

每孔加入100μL MTT，放入培養(yǎng)箱避光孵育4 h，吸除培養(yǎng)基，每孔加入600μL DMSO，低速震蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長下測定吸光度。

1.6　LDH檢測細胞活性

收集各組培養(yǎng)液樣本進行LDH檢測。按說明書步驟加標準品繪制標準曲線?？瞻卓准尤?5μL雙蒸水；標準孔加入5μL雙蒸水和20μL丙酮酸標準應用液；測定孔加入20μL待測樣品，5μL輔酶Ⅰ應用液；對照孔加入5μL雙蒸水和20μL待測樣品；各孔均加入25μL基質(zhì)緩沖液?；靹?，37℃溫浴15 min后各孔加入25μL 2，4-二硝基苯肼。混勻，37℃溫浴15 min后各孔加入250μL NaOH溶液?；靹?，室溫靜置5 min，用酶標儀在450 nm波長測定OD值。

1.7　ELISA檢測TNFα水平

各組培養(yǎng)液樣本按說明書步驟加標準品繪制標準曲線。樣本孔每孔加入50μL檢測緩沖液和50 μL樣本，每孔加入50μL檢測抗體。封板膜封板，300 r/min振蕩，室溫孵育2 h。棄液，每孔加洗液洗板6次。每孔加100μL稀釋的鏈霉親和素。封板膜封板，300 r/min振蕩，室溫孵育45 min。棄液，每孔加洗液洗板6次。每孔加入100μL顯色底物，避光室溫孵育30 min。加入100μL反應終止液，用酶標儀測定在450 nm最大吸收波長和570 nm參考波長下的OD值。

1.8　數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析方法

利用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計算各測量項目的均值和標準差，組間差異采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1　七氟烷處理對原代神經(jīng)元形態(tài)學的影響

4%七氟烷處理6 h后，相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代神經(jīng)元細胞分布稀疏，貼壁性降低，壞死脫落增加，部分神經(jīng)元崩解。神經(jīng)元胞體回縮，突起之間連接斷裂；BMSC預處理可以減少七氟烷對原代神經(jīng)元產(chǎn)生的形態(tài)學上的改變（圖1）。

圖1　各組原代神經(jīng)元細胞形態(tài)學改變（100×）Fig.1　Morphological changes of primary cultured neuron in each group(100×)

2.2　BMSC對七氟烷暴露后原代神經(jīng)元凋亡的影響

Western Blot結果顯示，七氟烷暴露對于未進行BMSC預處理組的原代神經(jīng)元細胞凋亡率的影響具有顯著差異 （P<0.01）；BMSC預處理可明顯降低由七氟烷暴露引起的原代神經(jīng)元凋亡（P<0.01）；而未經(jīng)七氟烷暴露組的原代神經(jīng)元中，BMSC預處理對其凋亡率的影響沒有統(tǒng)計學差異（圖2）。說明BMSC預處理可減輕七氟烷暴露導致的原代神經(jīng)元凋亡。

圖2　Western Blot檢測各組原代神經(jīng)元細胞凋亡情況Fig.2　The cell apoptosis of primary cultured neuron in each group by Western Blot examine

2.3　BMSC對七氟烷暴露的原代神經(jīng)元細胞活性的影響

MTT及LDH實驗的統(tǒng)計分析結果均顯示，七氟烷暴露對于未進行BMSC預處理組的原代神經(jīng)元細胞活性的影響具有統(tǒng)計學差異 （P<0.05）；BMSC預處理可緩解由七氟烷誘導的原代神經(jīng)元活性降低，差異顯著（P<0.05）；在未接受七氟烷處理組的原代神經(jīng)元中，BMSCs預處理對其細胞活性沒有明顯影響（圖3）。以上數(shù)據(jù)表明，BMSCs預處理可改善七氟烷暴露導致的原代神經(jīng)元活性降低。

圖3　MTT和LDH檢測各組原代神經(jīng)元細胞活性情況Fig.3　The cell viability of primary cultured neuron in each group by MTT and LDH examine

2.4　BMSC影響七氟烷暴露的原代神經(jīng)元TNFα水平

ELISA檢測顯示，七氟烷暴露增加了未進行BMSC預處理的原代神經(jīng)元上清TNFα水平，差異具有統(tǒng)計學意義 （P<0.01）；BMSC預處理可降低由七氟烷誘導的原代神經(jīng)元上清TNFα分泌水平，差異顯著（P<0.01）；在未接受七氟烷處理組的原代神經(jīng)元中，BMSC預處理對上清TNFα水平的影響沒有統(tǒng)計學差異。說明BMSC預處理可以減少七氟烷導致的TNFα大量釋放。

3　討論

本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)七氟烷暴露會導致原代神經(jīng)元細胞形態(tài)改變，引起細胞凋亡，細胞活性降低及TNFα釋放。TNFα有導致腫瘤細胞壞死、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等作用，又可作為應激反應指標。七氟烷暴露后，原代神經(jīng)元培養(yǎng)基中TNFα水平明顯增高，說明七氟烷使原代神經(jīng)元處于一種免疫失調(diào)、炎癥反應過度的狀態(tài)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，利用非接觸性共培養(yǎng)模型完成的BMSC預處理可以緩解這些損傷。BMSC可以分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞因子和其他與神經(jīng)保護相關的可溶性因子[7-9]，由此減少七氟烷導致的原代神經(jīng)元的凋亡，改善細胞活性的降低，減少TNFα釋放。說明BMSC預處理可以減輕七氟烷導致的神經(jīng)毒性損傷，且這種治療效果可能是通過改善七氟烷暴露后的炎癥反應和免疫功能失調(diào)達成的。這些發(fā)現(xiàn)為防治七氟烷的神經(jīng)毒性損傷提供了新的見解。鑒于七氟烷是一種被廣泛應用于臨床的吸入麻醉劑，我們應該對其臨床使用持有更謹慎的態(tài)度。

考慮到七氟烷引起的原代神經(jīng)元凋亡是一種氧化級聯(lián)反應，此類損傷一旦啟動將很難被克服[14]。故本研究選擇在七氟烷暴露之前用BMSC進行預處理。七氟烷造成的神經(jīng)損傷與其他不可預期的神經(jīng)損傷不同，絕大部分發(fā)生七氟烷暴露的手術都是擇期手術，BMSC的預防性處理也是符合基本臨床情況的。

BMSC已被證實可以分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞因子和其他胞外囊泡（EVs），并由此發(fā)揮其免疫抑制活性，且神經(jīng)保護功能也可能與細胞間接觸無關[15]。本研究的BMSCs預處理方法是通過Transwell小室構建的非接觸性共培養(yǎng)體系來完成的。因此，我們的研究也支持以上觀點，認為BMSC的抗七氟烷神經(jīng)毒性作用是通過分泌可溶性因子介導的。BMSC分泌的EVs包括外泌體、核外顆粒體、細胞微泡、微粒和凋亡小體等[16]。鑒于大多數(shù)EVs能夠通過血腦屏障且相對穩(wěn)定，確定具體的作用成分將對研究各種神經(jīng)毒性損傷的治療具有重大意義。

本研究存在一定的局限性。首先，BMSC是從新生SD大鼠中獲取的，而原代神經(jīng)元是從新生小鼠中獲得。在動物實驗中，人類、小鼠、大鼠的異種BMSC已被廣泛應用[17-19]，具有低免疫原性的優(yōu)點，這也使其成為臨床應用的理想工具。自體和同種異體BMSC已被證明可在人類中安全使用[20-21]。我們計劃分離出BMSC具體的有效成分進行下一步動物實驗，并發(fā)現(xiàn)其具體機制，由此更好地避免異種之間可能發(fā)生的排斥反應。其次，本次研究觀察的是七氟烷暴露后即刻的損傷，這可能不能完全模擬神經(jīng)損傷的完整狀態(tài)。在進一步的研究中，我們將延長觀察期。第三，這些結果均基于細胞實驗，仍需要在動物實驗中得到證實。

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