袁琳琳，王亞茹，曾衛(wèi)軍，謝紅桃，杜　鈺，盧　函，趙惠新

(新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830054)

轉(zhuǎn)錄因子，又稱反式作用因子，在真核生物生長、發(fā)育、分化、次生代謝等方面起重要的調(diào)控作用[1]。bHLH(堿性/螺旋-環(huán)-螺旋，basic/helix-loop-helix)是轉(zhuǎn)錄因子中的一個(gè)大家族，廣泛存在于真核生物中，一般具有一個(gè)約60個(gè)氨基酸的高度保守的結(jié)構(gòu)域，由2個(gè)功能不同的部分組成：堿性區(qū)域(basic region)和HLH區(qū)域(helix-loop-helix region)[2-3]。自1989年第一個(gè)植物bHLH蛋白結(jié)構(gòu)被鑒定出來[4]，目前已經(jīng)有不同植物的1 000多條bHLH序列得到鑒定[5]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)植物的黃酮類、單寧類、類萜、生物堿等次生代謝[6-11]，還參與了植物的生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆脅迫等許多生理過程[12-20]。如有研究證明擬南芥中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子ICE1(inducer of CBF expression)和ICE2能夠調(diào)控包括CBF(CRT binding factors)在內(nèi)的許多冷響應(yīng)元件，使植物表現(xiàn)出耐冷性和抗凍性[21-23]。山茶樹中的CsICE1基因的表達(dá)能夠被低溫誘導(dǎo)，并且表達(dá)量顯著升高[24]。水稻中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子OrbHLH001基因與ICE1類似，它在擬南芥中的過量表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥的抗鹽和抗凍的能力[25]。雖然對于植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、序列鑒定、功能驗(yàn)證等方面的研究取得了很大進(jìn)展，但是bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員數(shù)量眾多、調(diào)控功能多樣且復(fù)雜，不同植物的bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)及調(diào)控功能也有不同，因此還需要更深入的研究。

早春短命植物能在早春低溫環(huán)境中萌發(fā)并進(jìn)行生長，對早春的低溫具有較強(qiáng)的適應(yīng)性[26]，這是早春短命植物所必須具備的生態(tài)學(xué)特性。獨(dú)行菜(LepidiumapetalumWilld.)分布廣泛，世界各地海拔在400～2 000 m的地區(qū)幾乎都有分布，對溫度的適應(yīng)范圍較寬，且其種子為重要中藥，具有止咳、消腫、強(qiáng)心等功效，近年來引起眾多學(xué)者的關(guān)注。目前，有關(guān)獨(dú)行菜的研究也較多，如藥用開發(fā)及研究[27]、栽培方法與技術(shù)[28]、組織培養(yǎng)[29]、形態(tài)解剖[30]、C4相關(guān)結(jié)構(gòu)研究[31]、分子系統(tǒng)學(xué)[32]、種衣結(jié)構(gòu)與作用[33]等方面都有報(bào)道，國內(nèi)外還有學(xué)者將獨(dú)行菜作為粉塵、輻射等環(huán)境污染對植物及生態(tài)系統(tǒng)影響的評估物種[34-35]。對獨(dú)行菜萌發(fā)生理特性[36]、萌發(fā)過程對低溫耐受特性[37]、幼苗生長耐受低溫特性及機(jī)制[38]等相關(guān)的內(nèi)容也有一定的研究，但其調(diào)控機(jī)制仍遠(yuǎn)不清楚。

前期發(fā)現(xiàn)獨(dú)行菜種子萌發(fā)存在低溫停滯現(xiàn)象，而短時(shí)間較高溫度能解除其低溫停滯，且對萌發(fā)低溫停滯與解除停滯的獨(dú)行菜種子進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，其中發(fā)現(xiàn)了大量的bHLH家族基因，它們在獨(dú)行菜種子低溫萌發(fā)及幼苗生長過程中的作用，目前還沒有研究。因此，本研究對獨(dú)行菜種子萌發(fā)中低溫停滯與解除停滯兩組間的轉(zhuǎn)錄組bHLH家族基因進(jìn)行比較，并選擇植物耐冷相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員的ICE1基因進(jìn)行克隆、表達(dá)分析，為探討bHLH家族基因?qū)Κ?dú)行菜種子萌發(fā)及幼苗生長耐受低溫的分子調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　材　料

1.1.1獨(dú)行菜種子采集獨(dú)行菜種子于2015年5月15日采自烏魯木齊市鯉魚山。挑選出飽滿的種子，用98%濃硫酸處理45 s后，用濾紙盡量拭去濃硫酸后，蒸餾水清洗種子2～3次，備用。

1.1.2獨(dú)行菜種子低溫萌發(fā)耐受組及低溫萌發(fā)停滯組獲得參照李萍萍等的方法，將吸水的獨(dú)行菜種子置于4 ℃避光層積9 d，為低溫萌發(fā)停滯組種子，層積9 d后用25 ℃處理60 min，為低溫萌發(fā)耐受組種子[39-40]。

1.2　方　法

1.2.1獨(dú)行菜種子bHLH轉(zhuǎn)錄本篩選委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行高通量測序，獲得獨(dú)行菜種子轉(zhuǎn)錄組，采用關(guān)鍵詞bHLH篩選轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)一步分析是否包含bHLH保守結(jié)構(gòu)域，最后對每一條目標(biāo)序列在GenBank中進(jìn)行序列分析，并比較注釋，去除冗余序列。

1.2.2獨(dú)行菜種子bHLH轉(zhuǎn)錄本分類及注釋分析選擇Nr(NCBI non-redundant protein sequences)、GO(Gene Ontology)、KOG(euKaryotic Ortholog Groups)三大基因功能分析及蛋白序列分析數(shù)據(jù)庫，對篩選獲得的bHLH家族基因的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分類分析及功能注釋分析。

1.2.3獨(dú)行菜種子bHLH轉(zhuǎn)錄本表達(dá)顯著性分析轉(zhuǎn)錄組中bHLH基因表達(dá)水平的評估采用FPKM方法[40]。本研究將(實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量-對照組表達(dá)量)/對照組表達(dá)量≥0.5的基因定義為上調(diào)表達(dá)基因，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量/對照組表達(dá)量≤0.5的基因定義為下調(diào)表達(dá)基因，將(實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量-對照組表達(dá)量)/對照組表達(dá)量<0.5，且實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量/對照組表達(dá)量>0.5的基因定義為表達(dá)差異不顯著基因。

1.2.4轉(zhuǎn)錄組獨(dú)行菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量有效性分析以獨(dú)行菜Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用熒光定量RT-PCR技術(shù)，分析c20009_g1在低溫萌發(fā)耐受組和低溫萌發(fā)停滯組的獨(dú)行菜種子中的相對表達(dá)量，并與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫相對表達(dá)量進(jìn)行比較，確定轉(zhuǎn)錄組獨(dú)行菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量有效性。其中目標(biāo)基因熒光定量引物為L1(5′-TGACACTGCTTTTGAAT-3′)和L2(5′-ACCACATAACACTGAAT-3′)；內(nèi)參基因熒光定量引物為A1(5′-CCAAAGGCCAACAGAGAGA-3′)和A2(5′-TGA-GACACACCATCACCA-3′)。

1.2.5獨(dú)行菜IaICE1基因克隆及序列分析將25 ℃培養(yǎng)半個(gè)月的獨(dú)行菜幼苗置于4 ℃處理12 h，采用Trizol試劑法提取獨(dú)行菜幼苗總RNA；以根據(jù)轉(zhuǎn)錄本c20009_g1中開放閱讀框序列設(shè)計(jì)的ICE1擴(kuò)增引物P1(5′-AAAGGTGTCAACTTTGGCG-3′)和P2(5′-TTTAAAGGGACTTAGTTCT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測回收，委托上海生工進(jìn)行測序。用DNAMAN軟件對獲得的序列與c20009_g1進(jìn)行比對，并與擬南芥ICE1序列進(jìn)行比對，預(yù)測該開放閱讀框編碼蛋白序列，用ProtParam進(jìn)行分析該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量和親水特性，用TMHMM2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測和保守功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

1.2.6獨(dú)行菜幼苗laICE1基因表達(dá)受低溫脅迫的影響將25 ℃培養(yǎng)半個(gè)月的獨(dú)行菜幼苗分為6組，分別置于4 ℃處理0、1、2、6、12和24 h,采用熒光定量RT-PCR技術(shù)，分析獨(dú)行菜幼苗laICE1基因表達(dá)對低溫脅迫的響應(yīng)。引物見表1。

2　結(jié)果與分析

2.1　基于獨(dú)行菜種子轉(zhuǎn)錄組對bHLH類轉(zhuǎn)錄因子篩選

獨(dú)行菜種子轉(zhuǎn)錄組經(jīng)過高通量測序后，使用Trinity軟件進(jìn)行拼接，得到67 045條轉(zhuǎn)錄本序列，包含40 303條unigenes。以bHLH關(guān)鍵詞進(jìn)行查找，共找到203條unigenes，其中107條編碼產(chǎn)物具有bHLH保守結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步去除重復(fù)注釋等冗余，獨(dú)行菜種子萌發(fā)過程有83個(gè)bHLH家族成員表達(dá)。這83個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對應(yīng)的unigenes序列最長的為4 656 bp，最短的為204 bp，72%介于1 000～2 500 bp間；56條編碼完整閱讀框，27條編碼轉(zhuǎn)錄因子的部分序列。

2.2　獨(dú)行菜種子bHLH轉(zhuǎn)錄因子注釋分析

2.2.1獨(dú)行菜種子bHLH轉(zhuǎn)錄因子Nr注釋分析Nr是NCBI官方的蛋白序列數(shù)據(jù)庫，能夠全面反映被注釋的蛋白質(zhì)序列的信息[41]。由unigenes同源序列注釋圖(圖1)可知，獨(dú)行菜種子轉(zhuǎn)錄組中83個(gè)bHLH家族基因unigenes在Nr中被注釋到了7個(gè)物種中，其中與擬南芥(Arabidopsisthaliana)序列的注釋率最高，達(dá)到了30.5%，其次是琴葉擬南芥亞種(Arabidopsislyratasubsp.lyrata)，達(dá)到了28%。

圖1　bHLH家族基因unigenes在Nr庫中的注釋Fig.1　Lepidium apetalum bHLH family unigenes distribution in Nr

2.2.2獨(dú)行菜種子bHLH轉(zhuǎn)錄因子GO分類分析GO是一套國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能描述的分類系統(tǒng)，用來描述基因編碼的產(chǎn)物所參與的生物過程、所具有的分子功能及所處的細(xì)胞環(huán)境[42]。通過GO分類分析，獨(dú)行菜種子83條bHLH 中分別有46條、72條和45條被注釋到生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細(xì)胞組分(cellular component,CC)上(圖2)，BP、MF和CC都被注釋的有27條(圖3)。83條中87%的成員都注釋到了分子功能，但還有11條的分子功能沒有注釋，這為挖掘新功能bHLH轉(zhuǎn)錄因子提供了基礎(chǔ)。

2.2.3獨(dú)行菜種子bHLH轉(zhuǎn)錄因子KOG分類分析KOG是NCBI的基于基因直系同源關(guān)系，針對真核生物。因功能不同，已知植物基因在KOG中被分為26組，按A-Z編號[43]。獨(dú)行菜種子轉(zhuǎn)錄組中的83條bHLH基因序列，只有6條在KOG中被注釋。分別注釋到K(transcription，轉(zhuǎn)錄)、O(posttranslational modification, protein turnover, chaperones，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶)、R(general function prediction only，一般功能預(yù)測)和Y(Nuclear structure，核結(jié)構(gòu))類。其中，有3條與轉(zhuǎn)錄有關(guān)(表1)。

圖2　獨(dú)行菜bHLH家族基因unigenes的GO分類Fig.2　GO classification results of Lepidium apetalum bHLH family unigenes

2.3　獨(dú)行菜種子bHLH轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)分析

對獨(dú)行菜種子bHLH家族基因的83個(gè)成員表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，相對于低溫萌發(fā)停滯組，在低溫萌發(fā)耐受組的獨(dú)行菜種子中，有13個(gè)顯著上調(diào)，17個(gè)顯著下調(diào)，60個(gè)表達(dá)差異不顯著(圖4和5)。這顯著上調(diào)的13個(gè)bHLH家族基因，可能與種子萌發(fā)進(jìn)程密切相關(guān)，當(dāng)處于萌發(fā)低溫停滯期的種子，經(jīng)過誘導(dǎo)，這些基因及其他相關(guān)功能基因表達(dá)，從而解除了種子萌發(fā)停滯。另外17個(gè)下調(diào)序列，處于低溫下表達(dá)量高，經(jīng)較高溫度處理表達(dá)量下降，其可能與種子萌發(fā)過程中耐受低溫脅迫密切相關(guān)。其中下調(diào)最顯著的是c20009_g1序列，其經(jīng)Nr注釋和Blast分析，與植物冷耐受基因ICE1一致性最高，進(jìn)一步說明下調(diào)基因可能與種子萌發(fā)的低溫耐受有關(guān)。

為了進(jìn)一步檢測轉(zhuǎn)錄組中bHLH表達(dá)量是否相對準(zhǔn)確，本研究以c20009_g1為例，通過熒光定量RT-PCR對表達(dá)量進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果如圖6所示，c20009_g1在低溫萌發(fā)耐受組的行菜種子中，較低溫萌發(fā)停滯組的表達(dá)量極顯著下調(diào)，與其轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況(圖4)基本相符。

圖3　獨(dú)行菜bHLH家族基因unigenes的GO注釋分布Fig.3　bHLH family unigenes Lepidium apetalum distribution in GO

表1　獨(dú)行菜bHLH家族基因的KOG分類結(jié)果

圖4　獨(dú)行菜種子低溫萌發(fā)停滯解除前后bHLH家族基因相對表達(dá)量基于轉(zhuǎn)錄組分析Fig.4　Relative expression of bHLH family genes before and after germination at low temperature in the seeds of Lepidium apetalum, based on transcriptome analysis

圖5　解除停滯后bHLH家族基因相對表達(dá)差異Fig.5　Relative expression differences of bHLH family genes relieved germination stagnation at low temperature

對c20009_g1序列分析表明，該序列的開放閱讀框?yàn)? 503 bp，編碼的蛋白與擬南芥bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子ICE1一致性最高。本研究將c20009_g1序列對應(yīng)的基因命名為laICE1。

2.4　獨(dú)行菜laICE1基因克隆及序列分析

如上所述，laICE1在處于低溫狀態(tài)的獨(dú)行菜種子中表達(dá)量高，經(jīng)較高溫度處理后表達(dá)量下降，其可能與種子萌發(fā)過程中耐受低溫脅迫密切相關(guān)。進(jìn)一步采用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)從獨(dú)行菜幼苗中克隆cDNA序列，克隆產(chǎn)物經(jīng)測序后，得到與預(yù)期完全一致的cDNA序列，編碼500個(gè)aa組成的蛋白(圖7)。該序列與擬南芥ICE1基因相似性很高，達(dá)到95%，表明克隆獲得的序列為獨(dú)行菜ICE1基因序列。

圖6　bHLH成員ICE1相對表達(dá)量熒光定量PCR分析Fig.6　Relative expression of ICE1 of bHLH members by quantitative PCR

進(jìn)一步使用ProtParam對獨(dú)行菜laICE1編碼產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)測，表明該基因編碼一個(gè)分子量為54 635.19 kD、理論等電點(diǎn)為5.45、分子式為C2364H3742N688O758S22、不穩(wěn)定系數(shù)為52.25、平均疏水性為-0.494的不穩(wěn)定蛋白。使用TMHMM2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明，該蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域。laICE1的功能結(jié)構(gòu)域分析如圖8所示，其編碼產(chǎn)物包含HLH超家族的保守結(jié)構(gòu)域，HLH結(jié)構(gòu)域靠近肽鏈的C端，有2個(gè)主要由疏水氨基酸組成的α螺旋結(jié)構(gòu)，這2個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)由一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接，這與已知的bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)一致，表明laICE1屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子家族的編碼基因。

2.5　低溫脅迫對獨(dú)行菜幼苗laICE1基因表達(dá)的影響

熒光定量PCR結(jié)果分析表明，隨低溫處理時(shí)間的增加，laICE1基因表達(dá)量出現(xiàn)顯著變化，與對照組(0 h)比較，處理12 h時(shí)IaICE1基因表達(dá)量出現(xiàn)極顯著升高，升高倍數(shù)達(dá)到46倍之多，表明在低溫處理的初始階段，為了抵御低溫脅迫，獨(dú)行菜幼苗中的laICE1基因出現(xiàn)迅速反應(yīng);而隨著低溫脅迫時(shí)間的延長，雖然該基因表達(dá)量較對照組仍有顯著上調(diào)，但較處理12 h時(shí)不再增加(圖9)。這可能是由于獨(dú)行菜幼苗自身對低溫環(huán)境能快速適應(yīng)，基因laICE1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量已達(dá)到抗冷需求。

圖7　laICE1的cDNA全長序列及編碼氨基酸序列Fig.7　cDNA full-length sequence and putative amino acid sequence of laICE1

圖8　laICE1的結(jié)構(gòu)域分析Fig.8　Domain analysis of laICE1

不同小寫字母表示同期處理間在0.05水平上差異顯著( P < 0.05)圖9　低溫處理后獨(dú)行菜幼苗laICE1表達(dá)量Different letters indicate significant differences (P < 0.05) according to tukey’s multiple range testFig.9　The expression of laICE1 in seedlings of Lepidium apetalum at low temperature treatment

3　討　論

從轉(zhuǎn)錄組分析來看，bHLH類轉(zhuǎn)錄因子不同成員在獨(dú)行菜種子萌發(fā)低溫耐受組和低溫停滯組的表達(dá)量有所不同，有些成員在轉(zhuǎn)錄組包含的兩組種子中可能不表達(dá)，因此說明獨(dú)行菜bHLH類轉(zhuǎn)錄因子家族包含成員數(shù)應(yīng)該遠(yuǎn)在83個(gè)之上。

獲得的83個(gè)獨(dú)行菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄本，在Nr中被注釋到了7個(gè)物種中，這7個(gè)物種都是十字花科植物，分別是擬南芥(Arabidopsisthaliana)、琴葉擬南芥亞種(Arabidopsislyratasubsp.

lyrata)、薺菜(Capsellarubella)、山崳菜屬(Eutremasalsugineum)、小花南芥(Arabisalpina)、甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)、白菜型油菜(Brassicarapa)，這說明了植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子在進(jìn)化中種屬間保守性高。

通過對獨(dú)行菜種子轉(zhuǎn)錄組bHLH類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量分析、基因分類與功能注釋分析，表明部分獨(dú)行菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子在獨(dú)行菜生長、發(fā)育、代謝、應(yīng)答元素缺乏、低溫逆境脅迫中有作用，如c38862_g1注釋到POPEYE，可能對缺鐵條件下植物根的生長有重要作用[44]；如c16621_g1注釋到SPT，該基因編碼的一種bHLH轉(zhuǎn)錄因子在心皮邊緣和花粉殼體組織生長的全過程中都有表達(dá),還能夠調(diào)控葉片、花瓣、柱頭和根的一些特別組織的生長過程[45]，還與心皮發(fā)育有關(guān)[46]；如c9256_g1注釋到HEC2，其能夠調(diào)節(jié)雌性生殖組織的發(fā)育[47]；如c20009_g1注釋到ICE1，能夠在低溫條件下誘導(dǎo)CBF基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控CBF及其下游基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物耐受低溫的能力。本研究也通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)證實(shí)了laICE1在獨(dú)行菜幼苗中表達(dá)量受低溫誘導(dǎo)顯著上調(diào)，該基因可能確實(shí)對獨(dú)行菜種子萌發(fā)和幼苗生長過程的低溫耐受密切相關(guān)。

除了laICE1，獨(dú)行菜bHLH轉(zhuǎn)錄因子一些其他成員也可能對獨(dú)行菜耐受低溫脅迫起調(diào)控作用，尤其17個(gè)下調(diào)序列，它們在萌發(fā)過程處于低溫狀態(tài)的獨(dú)行菜種子中的表達(dá)量顯著高于經(jīng)較高溫度處理的獨(dú)行菜種子，其可能也與種子萌發(fā)過程中耐受低溫脅迫密切相關(guān)。而另外有13 bHLH家族基因，雖然在處于萌發(fā)低溫停滯期的種子表達(dá)量非常低，但在經(jīng)過較高溫度處理解除了種子萌發(fā)停滯的種子中表達(dá)量相對顯著，很可能它們在解除種子低溫萌發(fā)中起重要的調(diào)控作用，這需要后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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