孫紅蘭，劉慧峰，姜國丹

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院普外科，北京1011000

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，現(xiàn)已成為臨床上影響患者生活質(zhì)量甚至危及生命的嚴(yán)重疾病之一[1‐3]。目前結(jié)腸癌的腫瘤標(biāo)志物較多，磷酸化雷帕霉素靶蛋白（phosphor‐ylated mechanistic target of rapamycin，p‐MTOR）就是其中之一[4‐5]。p‐MTOR 是 AKT/MTOR 信號通路中的重要中心調(diào)控蛋白，主要調(diào)控細胞的生存、增殖以及凋亡，通過磷酸化下游多種蛋白的方式來調(diào)控基因的翻譯和轉(zhuǎn)錄，進而可調(diào)控蛋白質(zhì)合成和血管內(nèi)皮細胞增殖，因此有望成為腫瘤治療的新靶點，從而開發(fā)新的治療措施和治療藥物[6‐8]。本文通過研究p‐MTOR在結(jié)腸癌組織中表達的變化以及對預(yù)后的影響，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院收集的結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織標(biāo)本110例及其對應(yīng)的癌旁正常組織110例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)腸癌的診斷主要依據(jù)腸鏡活組織病理學(xué)、術(shù)后病理學(xué)結(jié)果；②結(jié)腸癌癌旁組織來源于距離腫瘤邊緣3 cm的結(jié)腸組織；③患者術(shù)前未接受放化療、免疫治療；④全身各系統(tǒng)無嚴(yán)重疾病；⑤患者的各項資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤疾??；②既往具有放化療病史；③伴其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病；④資料不完整難以納入統(tǒng)計。所有患者中，男62例，女48例；年齡37～79歲，平均（58.3±12.6）歲；TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期29例，Ⅲ期48例，Ⅳ期13例；組織學(xué)分級：高分化31例，中分化49例，低分化30例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例；腫瘤部位：乙狀結(jié)腸38例，升結(jié)腸21例，橫結(jié)腸29例，降結(jié)腸22例。

1.2 免疫組化檢測方法

所有石蠟標(biāo)本采用4 μm連續(xù)切片，逐級脫蠟至水，用H2O（23%）封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，后高溫高壓熱修復(fù)，牛血清（2%）封閉20 min，滴加羊抗人濃縮型多克隆抗體MTOR和一抗（p‐MTOR、HⅠF‐1α單抗的稀釋濃度分別為1∶100、1∶50），放入濕盒內(nèi)，冰箱（4℃）孵育過夜，然后滴加生物素標(biāo)記，保持室溫20 min，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉親和素，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，后進行脫水、透明及封片。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

p‐MTOR蛋白主要表達于細胞質(zhì)，陽性著色表達于細胞質(zhì)和細胞膜，呈黃色、棕黃色、褐色表達，免疫組化結(jié)果判定：①根據(jù)著色強度，0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為褐色、黑色；②根據(jù)陽性細胞比例，陽性細胞所占比例≤10%為1分，陽性細胞所占比例11%～50%為2分，陽性細胞所占比例51%～75%為3分，陽性細胞所占比例＞75%為4分。兩種積分相乘總分＜3分為陰性，≥3分為陽性；總分＜3分為“－”，總分3～5分為“+”，總分6～9分為“++”，總分＞9分為“+++”。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計-軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進行統(tǒng)計描述，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan‐Meier法，生存時間比較采用Log‐rank法；多因素分析采用Cox比例風(fēng)險回歸模型；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-MTOR蛋白表達水平

結(jié)腸癌組織中p‐MTOR蛋白陽性表達率為54.55%（60/110），明顯高于癌旁組織的10.00%（11/110），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=49.931，P＜0.01）。（表1、圖1）

2.2 結(jié)腸癌組織中p-MTOR蛋白陽性表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

110例結(jié)腸癌癌組織中，p‐MTOR蛋白陽性60例（54.55%），陰性50例（45.45%）；不同TNM分期、浸潤深度及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者結(jié)腸癌組織中p‐MTOR蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表1 兩種組織標(biāo)本中的p‐MTOR蛋白表達水平

圖1 p‐MTOR蛋白陽性表達的病理結(jié)果圖（免疫組化染色，×100）

表2 結(jié)腸癌組織中p‐MTOR蛋白陽性表達與患者臨床病理特征的關(guān)系[ n（%）]

2.3 結(jié)腸癌組織中p-MTOR蛋白陽性表達與患者預(yù)后的關(guān)系

結(jié)腸癌組織中p‐MTOR蛋白陽性表達患者的3年生存率（28.33%）明顯低于p‐MTOR蛋白陰性表達患者（55.00%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.364，P=0.004），詳見圖2；采用Cox比例風(fēng)險回歸模型進行分析結(jié)果顯示，TNMⅢ+Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤肌層、p‐MTOR蛋白陽性表達是結(jié)腸癌患者不良預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05），詳見表3。

3 討論

結(jié)腸癌是臨床上高發(fā)的消化道惡性腫瘤之一，隨著其發(fā)病率的逐年增加，其病死率也躍居中國惡性腫瘤第5位，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康，因此結(jié)腸癌的治療一直是臨床上的熱點問題。由于近年來對腫瘤細胞和分子水平研究的深入，提出了腫瘤干細胞的假說，即腫瘤細胞起始于一群具有增殖能力的細胞，進而維持腫瘤的不斷更新及分化，從而形成異質(zhì)細胞群體，因此在此假說基礎(chǔ)上的治療，可以通過抑制該類細胞的增殖分化，以達到治療的目的[9‐10]。據(jù)報道，多種惡性腫瘤的發(fā)生與PⅠ3K/AKT/MTOR信號通路活化密切相關(guān)，該通路可以加速細胞周期、降低細胞凋亡并促進腫瘤細胞的遷移，因此可以通過控制該通路的活化，從而抑制腫瘤細胞的生長[11‐12]。生長因子等物質(zhì)可經(jīng)過PⅠ3K/AKT/MTOR信號通路磷酸化MTOR的Ser2448位點，從而激活 MTOR，即為 p‐MTOR，p‐MTOR有助于維持細胞未分化的狀態(tài)，進而促進癌細胞去分化[13]。p‐MTOR可以改變S6k1和4E‐BP1的磷酸化狀態(tài)啟動翻譯過程，從而啟動HⅠF‐1的翻譯，提高HⅠF‐1的表達。被活化的p‐MTOR可通過抑制腫瘤細胞凋亡、加速血管生成、促進腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移和促進藥物抵抗等方面來加速腫瘤的病情發(fā)展，因此p‐MTOR作為該過程的核心蛋白，具有作為結(jié)腸癌治療新靶點的希望，在臨床上可以通過藥物等治療手段以抑制p‐MTOR的活性或活化過程，從而控制癌細胞的增殖、分化及轉(zhuǎn)移，從而抑制腫瘤的生長，達到治療的目的[14‐15]。

圖2 兩組患者的生存曲線圖

表3 結(jié)腸癌組織中p‐MTOR蛋白陽性表達與患者預(yù)后的關(guān)系

3.1 兩種組織標(biāo)本中p-MTOR蛋白表達水平的比較

p‐MTOR是結(jié)腸癌的重要腫瘤標(biāo)志物，是結(jié)腸癌癌細胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白酶，因此其水平可隨著結(jié)腸癌的發(fā)生而明顯升高，因此本文對比考察了結(jié)腸癌組織和癌旁組織的p‐MTOR陽性表達，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中p‐MTOR蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這表明p‐MTOR可以作為結(jié)腸癌特異性的腫瘤標(biāo)志物，p‐MTOR的表達水平和結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)。

3.2 結(jié)腸癌組織中p-MTOR蛋白陽性表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

臨床上常用TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度等臨床病理特征來評估結(jié)腸癌的發(fā)展程度，而結(jié)腸癌組織中p‐MTOR會參與到癌細胞增殖、分化、浸潤和轉(zhuǎn)移的全過程。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中p‐MTOR蛋白陽性表達率與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度有關(guān)，因此證明p‐MTOR蛋白陽性表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度具有對應(yīng)關(guān)系，p‐MTOR蛋白表達水平可以在一定程度上反映結(jié)腸癌病情發(fā)展的程度。

3.3 結(jié)腸癌組織中p-MTOR蛋白陽性表達與患者預(yù)后的關(guān)系

結(jié)腸癌癌細胞容易脫落擴散轉(zhuǎn)移，因此治療后患者易復(fù)發(fā)或在其他部位出現(xiàn)轉(zhuǎn)移癌，由于p‐MTOR在癌細胞增殖、分化、擴散、轉(zhuǎn)移的過程中均起到了重要作用，因此可以用其蛋白陽性表達情況來預(yù)測結(jié)腸癌的預(yù)后。本研究討論了p‐MTOR蛋白陽性表達與患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)p‐MTOR蛋白陽性表達患者的3年生存率低于p‐MTOR蛋白陰性表達患者；采用Cox比例風(fēng)險回歸模型進行分析結(jié)果顯示，TNM分期增高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤肌層、p‐MTOR蛋白陽性表達是結(jié)腸癌患者不良預(yù)后的獨立危險因素，這表明p‐MTOR蛋白陽性表達可以促進癌癥的復(fù)發(fā)和擴散，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量，導(dǎo)致不良預(yù)后的發(fā)生，而p‐MTOR蛋白陽性表達與TNM分期增高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及浸潤肌層等病理特征一樣，可作為癌癥發(fā)生發(fā)展的促進因素之一，因此臨床可以通過控制p‐MTOR蛋白陽性表達來治療結(jié)腸癌。

綜上所述，本文通過研究p‐MTOR陽性表達水平與結(jié)腸癌組織、臨床病理特征以及患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)p‐MTOR陽性表達水平與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可在一定程度上反映結(jié)腸癌病情發(fā)展的程度并是結(jié)腸癌發(fā)生的獨立危險因素，因此臨床上可以通過抑制p‐MTOR陽性表達，從而控制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后的發(fā)生。

[1]張芬,石振旺,王志紅.結(jié)直腸癌篩查技術(shù)的研究進展[J].國際消化病雜志,2016,36(6):343‐346.

[2]金鮮珍,陳瑾,廖春艷,等.持續(xù)性護理對結(jié)腸癌患者術(shù)后生活質(zhì)量的影響[J].山西醫(yī)藥雜志,2015,44(21):2584‐2586.

[3]Wynder EL,Reddy BS.Colon cancer prevention:today’s challenge to biomedical scientists and clinical investigators[J].Cancer,1977,40(5 Suppl):2565‐2571.

[4]許星宇,陳博,熊茂明.p‐mTOR在胃癌組織中的表達與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系[J].中華普通外科雜志,2016,31(2):145‐148.

[5]馬志恒,蔣海存,陳建新,等.mTOR信號通路與胃癌的相關(guān)性研究[J].國際消化病雜志,2016,36(4):256‐258.

[6]張春,李清漪,董海影,等.PⅠ3K/AKT/mTOR信號通路在誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡中的作用[J].中國新藥雜志,2016,25(16):1909‐1912.

[7]Zhang X,Shi H,Tang H,et al.miR‐218 inhibits the inva‐sion and migration of colon cancer cells by targeting the PⅠ3K/Akt/mTOR signaling pathway[J].Ⅰnt J Mol Med,2015,35(5):1301‐1308.

[8]Chen J,Shao R,Li F,et al.PⅠ3K/Akt/mTOR pathway dual inhibitor BEZ235 suppresses the stemness of colon cancer stem cells[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2015,42(12):1317‐1326.

[9]李姍姍,邊育紅,王麗.基于腫瘤干細胞的西黃丸抗結(jié)腸癌作用研究[J].天津中醫(yī)藥,2017,34(3):181‐185.

[10]曲澤,侯明星,王峰.結(jié)腸癌腫瘤干細胞相關(guān)因子研究進展[J].中國腫瘤臨床與康復(fù),2017,24(3):376‐380.

[11]郭琳,王強.PⅠ3K/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)通路與惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2009,17(8):1585‐1589.

[12]Manfredi GⅠ,Dicitore A,Gaudenzi G,et al.PⅠ3K/Akt/mTOR signaling in medullary thyroid cancer:a promising molecular target for cancer therapy[J].Endocrine,2015,48(2):363‐370.

[13]劉田田,畢經(jīng)旺.PⅠ3K/Akt/mTOR信號通路與結(jié)直腸惡性腫瘤[J].實用醫(yī)藥雜志,2016,33(4):367‐370;374.

[14]王茜,時延龍,畢經(jīng)旺.p‐mTOR與HⅠF‐1α在結(jié)直腸癌組織中的表達及其臨床意義[J].中國腫瘤生物治療雜志,2015,22(6):779‐784.

[15]張少華,畢經(jīng)旺.結(jié)直腸癌組織中S6K1及4EBP1蛋白的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系[J].中國腫瘤生物治療雜志,2015,22(6):747‐753.