李瀚，顧磊#，李彤，張利紅

鄂東醫(yī)療集團(tuán)市中醫(yī)醫(yī)院（市傳染病醫(yī)院）1病理科，2腫瘤外科，3檢驗(yàn)科，湖北黃石4350000

SIX1基因可特異性調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡，參與胚胎細(xì)胞發(fā)育和器官分化，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中具有重要價(jià)值[1‐2]。研究發(fā)現(xiàn)SIX1基因在乳腺癌、宮頸癌和結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，在其病情及預(yù)后評估中具有重要價(jià)值，可能較傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物具有更高的準(zhǔn)確度和特異度[3‐4]。本研究檢測胃癌患者及慢性胃炎患者SⅠX1蛋白表達(dá)情況，研究其在胃癌病情評估中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2010年1月至2017年1月鄂東醫(yī)療集團(tuán)市中醫(yī)醫(yī)院診治的60例胃癌患者的病歷資料為胃癌組，均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)胃鏡活檢病理組織學(xué)檢查、增強(qiáng)CT檢查和（或）手術(shù)切除標(biāo)本病理組織學(xué)檢查確診為胃癌；②首次手術(shù)治療，非二次手術(shù)，既往未行手術(shù)、化療或放療治療；③無其他包括腫瘤等疾病，無嚴(yán)重心、腦、肺疾?。虎軣o手術(shù)禁忌證。另選擇同期行胃鏡活檢病理組織學(xué)檢查結(jié)果為慢性胃炎的30例患者的病歷資料為對照組。兩組患者性別、年齡、吸煙史、酗酒史和體重指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，詳見表1。

1.2 細(xì)胞與試劑

正常人胃黏膜細(xì)胞系（GES‐1）和胃癌細(xì)胞系（AGS、SGC‐7901和KATO‐Ⅲ）購自美國ATCC公司。兔抗人SⅠX1抗體購自美國Sigma公司，SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自碧云天生物科技公司。幽門螺桿菌檢測采用14C呼氣試驗(yàn)檢測。腫瘤最大徑采用刻度尺直接測量手術(shù)切除標(biāo)本原發(fā)灶。

表1 兩組患者的一般資料

1.3 胃癌組患者SIX 1蛋白表達(dá)檢測

胃癌組胃癌患者取胃癌組織和癌旁正常組織（距離腫瘤組織3 cm），對照組慢性胃炎患者取胃鏡活檢組織，采用SP法檢測SⅠX1蛋白表達(dá)，標(biāo)本加入兔抗人SⅠX1抗體一抗后37℃孵育2 h，后加入酶標(biāo)二抗室溫下孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（di‐aminobenzidine，DAB）顯色劑顯色15 min。SⅠX1蛋白陽性染色呈棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)和核仁，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)的比例將染色結(jié)果分為3級(jí)：陰性為陽性細(xì)胞數(shù)占0～10%，陽性為陽性細(xì)胞數(shù)占11%～50%，強(qiáng)陽性為陽性細(xì)胞數(shù)占50%以上，陽性和強(qiáng)陽性被定義為蛋白表達(dá)陽性。

1.4 胃癌細(xì)胞系SIX 1蛋白表達(dá)檢測

采用Western blot法檢測正常人胃黏膜細(xì)胞系GES‐1和胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、SGC‐7901和KATO‐Ⅲ的SⅠX1蛋白表達(dá)，選擇β‐actin為內(nèi)參照。檢測方法如下：采用 Trizol提取 GES‐1、AGS、SGC‐7901和KATO‐Ⅲ胃癌細(xì)胞系蛋白質(zhì)，加入兔抗人SⅠX1抗體，顯色后，計(jì)算SⅠX1蛋白與內(nèi)參β‐actin表達(dá)百分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK‐q檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組與對照組SIX 1蛋白表達(dá)的比較

胃癌組胃癌組織SⅠX1蛋白表達(dá)陽性41例，陽性表達(dá)率為68.3%；癌旁正常組織SⅠX1蛋白表達(dá)陽性為1例，陽性表達(dá)率為1.7%；對照組慢性胃炎組織SⅠX1蛋白表達(dá)陽性為1例，陽性表達(dá)率為3.3%；胃癌組胃癌組織SⅠX1蛋白表達(dá)陽性率高于癌旁組織和對照組慢性胃炎組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 胃癌組織SIX 1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

不同性別、年齡、病變位置、病理類型和是否患幽門螺桿菌感染的胃癌組織SⅠX1蛋白陽性表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；中+低分化、腫瘤最大徑≥5 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為 N2～3、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及病理分期為Ⅲ+Ⅳ期患者胃癌組織SⅠX1蛋白陽性表達(dá)高于高分化、腫瘤最大徑＜5 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N0～1、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及病理分期為Ⅰ+Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 胃癌組織SⅠX 1蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

2.3 胃癌細(xì)胞系SIX 1蛋白表達(dá)情況

胃癌細(xì)胞系 AGS、SGC‐7901和 KATO‐Ⅲ中SⅠX1蛋白表達(dá)均高于正常人胃黏膜細(xì)胞系GES‐1，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1）

3 討論

胃癌的發(fā)病機(jī)制與多種因素有關(guān)，其中基因表達(dá)異常是最重要的發(fā)病機(jī)制，包括基因突變、單核苷酸多態(tài)性及表觀遺傳學(xué)等眾多機(jī)制，與胃癌基因表達(dá)密切相關(guān)。SIX1基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是E2F1的轉(zhuǎn)錄靶基因，在G1～S期轉(zhuǎn)錄激活，S期轉(zhuǎn)錄水平增加。SⅠX1通過激活靶基因如Cyclin A1、Cyclin D1等，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，抑制與DNA結(jié)合的能力，最后在有絲分裂后期經(jīng)蛋白水解降解[5‐6]，而SⅠX1的過表達(dá)則削弱了這一作用，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，造成細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。此外，SⅠX1作為磷酸化蛋白，可被酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化失活，從而調(diào)控細(xì)胞周期G1～M期的轉(zhuǎn)變，尤其對DNA損傷的反應(yīng)[7‐8]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，SⅠX1蛋白表達(dá)在多種惡性腫瘤中顯著上升，可能與病情及預(yù)后密切相關(guān)。王彤等[9]采用免疫組織化學(xué)SP法檢測宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織及正常宮頸組織中SⅠX1蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織SⅠX1蛋白陽性表達(dá)率高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組織及正常宮頸組織，認(rèn)為SⅠX1與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能成為預(yù)測宮頸癌侵襲與轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物。魏巧等[10]發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者SⅠX1蛋白在癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SⅠX1蛋白表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤浸潤深度及生存狀態(tài)有關(guān)，認(rèn)為SⅠX1蛋白高表達(dá)是食管鱗癌患者預(yù)后不良的因素，可作為臨床預(yù)測食管鱗癌患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究中，胃癌患者癌組織中SⅠX1蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁組織和慢性胃炎組織，胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、SGC‐7901和KA‐TO‐Ⅲ中SⅠX1蛋白陽性表達(dá)均高于正常人胃黏膜細(xì)胞GES‐1（P＜0.05），這些證據(jù)證實(shí)SⅠX1蛋白表達(dá)異常與胃癌的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

圖1 正常人胃黏膜細(xì)胞系GES‐ 1和胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、SGC‐7901和KATO‐Ⅲ中SⅠX 1蛋白表達(dá)情況

傳統(tǒng)的胃癌病情評估指標(biāo)包括分化程度、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和病理分期，這些指標(biāo)與病情及預(yù)后密切相關(guān)，可客觀科學(xué)地反映胃癌患者的病情及預(yù)后，但這些傳統(tǒng)指標(biāo)多通過手術(shù)切除標(biāo)本病理組織學(xué)檢查獲得，對于無法獲取標(biāo)本患者則不適用而限制其臨床應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)不同性別、年齡、病變位置、病理類型和是否患幽門螺桿菌感染的胃癌組織SⅠX1蛋白陽性表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同分化程度、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和病理分期患者胃癌組織SⅠX1蛋白陽性表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中+低分化、腫瘤最大徑≥5 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N2～3、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及病理分期為Ⅲ+Ⅳ期患者胃癌組織SⅠX1蛋白陽性表達(dá)高于高分化、腫瘤最大徑＜5 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N0～1、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及病理分期為Ⅰ+Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這些證據(jù)表明SⅠX1蛋白表達(dá)與胃癌的病情嚴(yán)重程度有關(guān)，可能SⅠX1蛋白陽性表達(dá)越高，胃癌病情越嚴(yán)重。SIX1基因可用于預(yù)測胃癌的病情，隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，可能通過術(shù)前檢測外周血或胃鏡活檢組織SⅠX1蛋白表達(dá)即可提供客觀科學(xué)證據(jù)，較傳統(tǒng)的評估指標(biāo)可能具有更高的準(zhǔn)確度及特異度，臨床應(yīng)用價(jià)值更高。值得注意的是，本研究對胃癌患者預(yù)后無相關(guān)研究，相信隨著研究不斷深入，SⅠX1蛋白表達(dá)的檢測可能在胃癌預(yù)后評估中具有一定價(jià)值。

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