朱勇，朱媛，魯正學(xué)，李偉

重慶市長(zhǎng)壽區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，重慶4012200

胃癌在中國(guó)是最常見的惡性腫瘤之一，并且絕大多數(shù)的胃癌患者在確診時(shí)病情已進(jìn)展到中晚期，常發(fā)生腹膜、肝臟、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，胃癌患者的5年生存期較短，預(yù)后較差[1]。隨著對(duì)胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的深入研究，發(fā)現(xiàn)胃癌腫瘤組織內(nèi)存在數(shù)量不多的惡性細(xì)胞亞群，即腫瘤干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞在腫瘤形成、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制和如何靶向治療特異性腫瘤干細(xì)胞已成為目前研究的熱點(diǎn)[2]。目前證實(shí)了人胃癌組織中也含有腫瘤干細(xì)胞，此外，在多株體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞系內(nèi)也得到進(jìn)一步的證實(shí)，有少量具有干細(xì)胞樣特性的胃癌腫瘤干細(xì)胞的存在，并且，有關(guān)胃癌腫瘤干細(xì)胞方面的研究也取得了一定的進(jìn)展[3‐4]。Snail可通過多種途徑促使上皮‐間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial‐mesenchymal transition，EMT），在許多腫瘤組織中呈中高表達(dá)，被視為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)因素。另外，異常表達(dá)的Snail不僅可以有效地介導(dǎo)細(xì)胞存活，并使其獲得干細(xì)胞樣特性，還可以誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞的存在。而雌激素受體（estrogen receptor，ER）的缺失與Snail高表達(dá)相關(guān)聯(lián)，即ER‐α36介導(dǎo)的雌激素信號(hào)能促進(jìn)SGC7901細(xì)胞的增殖與侵襲，ER‐α36介導(dǎo)的雌激素信號(hào)途徑可能通過Snail作用于胃癌腫瘤干細(xì)胞[5‐7]。Snail蛋白作為參與EMT過程的重要分子，其在胃癌腫瘤干細(xì)胞形成過程中的作用及機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系：空載體轉(zhuǎn)染的人胃癌細(xì)胞系SGC7901（由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室饋贈(zèng)），本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的穩(wěn)定高表達(dá)ER‐α36的SGC7901細(xì)胞株High36、穩(wěn)定沉默ER‐α36的SGC7901細(xì)胞株Low36。

實(shí)驗(yàn)試劑：胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，青霉素‐鏈霉素和谷氨酰胺購(gòu)自北京碧云天生物科技有限公司，優(yōu)質(zhì)胎牛血清FBS購(gòu)自澳洲，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，無酚紅DMEM/F12購(gòu)自杭州吉諾公司，EGF購(gòu)自 Gali‐Bio公司，F(xiàn)GF購(gòu)自PeproTech公司，B27購(gòu)自Gibco公司，17β‐雌二醇（17β‐Estradiol，E2β）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，糖皮質(zhì)激素氫化可的松（hydrocortisone）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，細(xì)胞裂解液RⅠPA購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京碧云天生物科技有限公司，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢飛弈生物科技有限公司，甘油購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，蛋白MARKER購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司，0.22μmol/L PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京碧云天生物科技有限公司，CD24、CD44抗體購(gòu)自BD公司，Snail抗體購(gòu)自Abcam公司，ER‐α36抗體由美國(guó)Creighton大學(xué)王兆一教授饋贈(zèng)，F(xiàn)ⅠTC‐標(biāo)記山羊抗兔購(gòu)自Thermo公司，hoechst33258細(xì)胞核染色劑購(gòu)自北京碧云天生物科技有限公司，無水乙醇和甲醇及甲醛分析純購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞球的培養(yǎng)取交替培養(yǎng)于含80%FBS培養(yǎng)瓶的SGC7901細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2次后，經(jīng)胰酶消化至輕輕晃動(dòng)，使細(xì)胞可完全脫落，再放置1 min后，加入SSM終止消化，輕輕機(jī)械吹打數(shù)次，收集細(xì)胞，1200 rpm，離心3 min，去上清后加入無血清培養(yǎng)基（serum free medium，SFM）輕輕吹打數(shù)次，使細(xì)胞成單細(xì)胞培養(yǎng)液。取100μl的細(xì)胞懸液加900μl PBS稀釋，用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后重懸于SFM中，細(xì)胞以5×103/ml的密度分別接種于100 mm普通的培養(yǎng)皿和超低吸附培養(yǎng)皿中，補(bǔ)充SFM至總培養(yǎng)液體積為10 ml。放置于37℃、5%CO2、95%濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至第4天換液。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞球HE染色當(dāng)培養(yǎng)皿中形成腫瘤細(xì)胞球（1周）后收集細(xì)胞球，低速離心去上清液。加入新鮮配制的4%多聚甲醛固定30 min，涂在用0.5%明膠處理好的載玻片上，自然晾干。使用蘇木素液染色（5～10 min），培養(yǎng)基中加入流水洗去蘇木素液（1 min）、1%鹽酸‐酒精（1～3 s）、流水沖洗（10～15 min）、蒸餾水洗（1～2 min）、0.5%伊紅液染色（1～3 min）、蒸餾水稍洗（1～2 s）、80%乙醇（1～2 s）、95%乙醇Ⅰ（2～3 min）、95%乙醇Ⅱ（2～3 min）、無水乙醇Ⅰ（3～5 min）、無水乙醇Ⅱ（3～5 min）、二甲苯Ⅰ（3～5 min）、二甲苯Ⅱ（3～5 min）、二甲苯Ⅲ（3～5 min）。使用中性樹膠封固并于倒置顯微鏡下拍照。

1.2.3 Westernblot鑒定腫瘤細(xì)胞球中Snail及相關(guān)蛋白的表達(dá)收集無血清懸浮培養(yǎng)1周的腫瘤細(xì)胞球，2000 rpm，離心5 min。棄上清，加入4 ml的PBS，并用移液槍輕輕吹打混勻，然后，2000 rpm，離心5 min。棄上清后，再用1 ml的PBS重復(fù)洗滌1次。棄上清，放置冰上。配制含1%膽堿脂酶抑制劑（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的細(xì)胞裂解液。向離心管中加入適量現(xiàn)配現(xiàn)用的PMSF細(xì)胞裂解液后，置于冰上裂解30 min，每5～10 min漩渦震蕩1次。裂解完成后，置于4℃高速冷凍離心機(jī)內(nèi)，于16 000 rpm下離心15 min，收集上清即所需蛋白原液。取2μl蛋白原樣加18μl的PBS溶液稀釋10倍，與6組BSA蛋白標(biāo)液樣品一起點(diǎn)樣到96孔板上，其中，每孔蛋白液樣品5μl，蛋白定量液96μl，每個(gè)蛋白液點(diǎn)3個(gè)孔，點(diǎn)樣完成后，在37℃的搖床上震蕩，孵育30 min。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)96孔板內(nèi)蛋白在A492波長(zhǎng)下的吸光度值，并通過Excel表格制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出計(jì)算公式，算出蛋白原液的濃度。采用Biostep Photoimpact凝膠分析系統(tǒng)軟件測(cè)量各組目的蛋白與β‐actin條帶的平均光密度值,計(jì)算兩者的比值，進(jìn)行相對(duì)定量。將經(jīng)過去除雌激素影響的細(xì)胞用無酚紅培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對(duì)照組，比較SGC7901研究組和SGC7901對(duì)照組中Snail+細(xì)胞含量、Snail蛋白表達(dá)情況。將SGC7901、High36及Low36細(xì)胞中ER‐α36蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)；多組均數(shù)間比較采用F檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞球體內(nèi)Snail+細(xì)胞含量及Snail蛋白的表達(dá)

SGC7901對(duì)照組的Snail+細(xì)胞含量明顯高于SGC7901研究組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而SGC7901對(duì)照組的Snail蛋白表達(dá)低于SGC7901研究組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 腫瘤細(xì)胞球體內(nèi)Snail+細(xì)胞含量及Snail蛋白的表達(dá)（± s）

表1 腫瘤細(xì)胞球體內(nèi)Snail+細(xì)胞含量及Snail蛋白的表達(dá)（± s）

組別SGC7901對(duì)照組SGC7901研究組t值P值40.12±3.21 0.33±0.07 27.711 0.001 0.66±0.12 1.13±0.11 6.456 0.030 Snail+細(xì)胞含量（%）Snail蛋白（g/L）

2.2 ER- α36對(duì)胃癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SGC7901對(duì)照組、High36組、Low36組ER‐α36蛋白和Snail蛋白的表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。High36形成的腫瘤細(xì)胞球數(shù)量多于SGC7901對(duì)照組，而Low36形成的腫瘤細(xì)胞球數(shù)量低于SGC7901對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。上調(diào)ER‐α36細(xì)胞High36組的腫瘤細(xì)胞球體內(nèi)Snail蛋白的表達(dá)高于SGC7901‐對(duì)照組，而Low36組的腫瘤細(xì)胞球體內(nèi)Snail蛋白的表達(dá)低于SGC7901‐對(duì)照組（P＜0.05）。（表2）

表2 SGC7901、High36及Lo-w36細(xì)胞中ER‐ α36蛋白和Snail蛋白的表達(dá)（g/L，± s）

表2 SGC7901、High36及Lo-w36細(xì)胞中ER‐ α36蛋白和Snail蛋白的表達(dá)（g/L，± s）

注：*與SGC7901對(duì)照組比較，P＜0.05

細(xì)胞SGC7901對(duì)照組High36 Low36 F值P值1.00±0.01 1.61±0.13*0.36±0.09*233.468 0.000 1.00±0.01 2.21±0.13*0.27±0.08*615.449 0.000 ER‐α36蛋白Snail蛋白

2.3 不同濃度ER預(yù)處理對(duì)于ER- α36和Snail表達(dá)的影響

低濃度ER處理組懸浮培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞球體內(nèi)Snail蛋白和ER‐α36的表達(dá)高于無ER處理的對(duì)照組（P＜0.05）；而高濃度ER處理組懸浮培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞球體內(nèi)Snail蛋白和ER‐α36的表達(dá)，低于無ER處理的對(duì)照組（P＜0.05）。（表3）

表3 不同濃度ER處理后各組腫瘤細(xì)胞球體內(nèi)ER‐ α36和Snail的表達(dá)（g/L，± s）

表3 不同濃度ER處理后各組腫瘤細(xì)胞球體內(nèi)ER‐ α36和Snail的表達(dá)（g/L，± s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組1 μmol組0.1 μmol組F值P值1.00±.0.01 0.68±0.13*1.29±0.08*59.679 0.000 1.00±0.01 0.52±0.11*1.93±0.21*136.918 0.000 ER‐α36Snail

3 討論

在體外如何獲得更多的胃癌干細(xì)胞，胃癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物有哪些，胃癌組織中腫瘤干細(xì)胞的形成機(jī)制，這些都是研究胃癌重要生物學(xué)行為所面臨的實(shí)際問題。本研究應(yīng)用超低吸附培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系SGC7901較應(yīng)用普通培養(yǎng)皿可更多更好地獲得腫瘤細(xì)胞球體。對(duì)腫瘤細(xì)胞球體細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞懸液后，全部繼續(xù)進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞球細(xì)胞仍能夠進(jìn)行分裂增殖，并穩(wěn)定傳至第4代，即表現(xiàn)出干細(xì)胞樣的特征性能力之一，即自我更新的能力。這些腫瘤細(xì)胞球體內(nèi)存在能夠不斷增殖，具有自我增殖的能力，與Deng等[4]的研究結(jié)果相似。

Snail作為轉(zhuǎn)錄因子，其在調(diào)節(jié)胚胎著床及細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮極大的作用。同時(shí)有大量文獻(xiàn)報(bào)道，Snail可通過不同途徑促使 EMT[5‐7]，EMT主要在腫瘤早期發(fā)生，是腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的主要原因之一。Snail可促使細(xì)胞內(nèi)E‐鈣黏著蛋白及橋粒芯糖蛋白的表達(dá)下降，從而使細(xì)胞具有遷移性。此外，Snail還可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞存活，誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞形成[8]。在乳腺癌中異常表達(dá)的Snail，不僅能夠提高腫瘤細(xì)胞形成具有乳腺上皮細(xì)胞相關(guān)特性的微球體和腫瘤種植能力，還能夠提高腫瘤細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志物的能力。此外，Snail可以有效地介導(dǎo)細(xì)胞存活，并使細(xì)胞具有干細(xì)胞樣特性。Sato等[9]在長(zhǎng)期暴露于尼古丁中的口腔上皮中發(fā)現(xiàn)，敲除Snail基因后，腫瘤干細(xì)胞性能的增強(qiáng)及EMT得到逆轉(zhuǎn)。由此推測(cè)，Snail可能也作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物通過某一信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)胃癌腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]。Snail蛋白作為參與EMT及誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞存在的重要分子，其在胃癌腫瘤干細(xì)胞中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

新近發(fā)現(xiàn)的雌激素受體ER‐α36是ER‐α的新亞型，在ER‐α66陰性的乳腺癌中，ER‐α36通過激活多條信號(hào)通路刺激乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，ER‐α36在組織中的表達(dá)與ER‐α66的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，并且在ER陰性的乳腺癌中，Snail表達(dá)明顯升高[12]。前期有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)生發(fā)展與ER‐α36介導(dǎo)的雌激素之間也存在相關(guān)性，ER‐α36介導(dǎo)的雌激素信號(hào)能夠促進(jìn)SGC7901細(xì)胞增殖與侵襲[13]。因此，推測(cè)ER‐α36介導(dǎo)的雌激素信號(hào)可能與形成胃癌腫瘤干細(xì)胞有關(guān)，但目前未見相關(guān)報(bào)道。

在得到上述結(jié)果及前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，又應(yīng)用無血清以及超低吸附培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系SGC7901及SGC7901重組細(xì)胞系High36和Low36，并對(duì)SGC7901腫瘤細(xì)胞球進(jìn)行不同濃度的ER（1 μmol、0.1 μmol）處理。應(yīng)用倒置顯微鏡觀察各組腫瘤細(xì)胞球的大小和形狀，并在鏡下利用熱點(diǎn)計(jì)數(shù)法計(jì)算腫瘤細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果顯示，低濃度ER和ER‐α36蛋白上調(diào)均與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞球的形成有關(guān)。另外，本項(xiàng)研究還對(duì)各組腫瘤細(xì)胞球中細(xì)胞進(jìn)行傳代，繼續(xù)無血清懸浮培養(yǎng)，計(jì)數(shù)每一代腫瘤細(xì)胞球中的細(xì)胞數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度ER和上調(diào)ER‐α36均與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞球細(xì)胞分裂增殖有關(guān)（P＜0.05）。此外，通過對(duì)不同濃度ER處理形成的腫瘤細(xì)胞球及重組細(xì)胞系High36和Low36腫瘤細(xì)胞球中Snail蛋白表達(dá)的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，在低濃度ER處理懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞腫瘤細(xì)胞球中Snail蛋白高表達(dá)的同時(shí)，伴有ER‐α36表達(dá)的升高，而高濃度的ER處理作用卻相反。最新的研究發(fā)現(xiàn)，Snail參與ER‐α促進(jìn)EMT過程，并促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[14]，針對(duì)性地抑制ER‐α表達(dá)，同時(shí)也抑制了Snail蛋白的表達(dá)[15‐16]。因此，根據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，推測(cè)ER‐α36‐Snail信號(hào)可能具有促進(jìn)CSC樣細(xì)胞生長(zhǎng)作用，Snail通過ER‐α36介導(dǎo)的雌激素信號(hào)在胃癌腫瘤干細(xì)胞中的作用機(jī)制有待我們進(jìn)行下一步的深入研究。

綜上所述，本研究應(yīng)用超低吸附皿無血清懸浮培養(yǎng)的方法，可穩(wěn)定獲得能夠不斷增殖、具有自我更新能力的胃癌腫瘤細(xì)胞球體。Snail在這些腫瘤細(xì)胞球體內(nèi)細(xì)胞含量明顯增高，且Snail蛋白也呈中高表達(dá)，低濃度ER刺激可以誘導(dǎo)Snail及ER‐α36的高表達(dá)。因此，Snail在ER‐α36信號(hào)通路促進(jìn)胃癌腫瘤干細(xì)胞樣成球中可能具有重要作用。

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