丁相福，王婷婷，王輝，袁偉杰，徐廣甍

吉林大學(xué)第二醫(yī)院1甲狀腺外科，2血液科，4結(jié)直腸外科，長(zhǎng)春130041 3長(zhǎng)春市南關(guān)區(qū)醫(yī)院綜合外科，長(zhǎng)春1300410

胃癌在早期可以發(fā)生轉(zhuǎn)移，進(jìn)展期胃癌的手術(shù)切除率低，放化療的不良反應(yīng)大，5年生存率約為30%，尋找一種新的治療方案成為目前胃癌研究的一個(gè)重要的課題。近年來(lái)，隨著胃癌的分子生物學(xué)研究進(jìn)展，人們認(rèn)識(shí)到胃癌的發(fā)生主要與癌基因的突變、擴(kuò)增、過(guò)度表達(dá)以及抑癌基因的突變、失活等密切相關(guān)；因此，在基因水平治療胃癌是未來(lái)的發(fā)展方向。

MED19是2003年克隆的新基因，位于染色體的11q12.1位置，編碼一種與酵母中促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的Mediator 19（MED19）同源蛋白，是中介因子復(fù)合體的亞基。MED19在酵母菌的曾用名為ROX3、SSN7和RMR1等。MED19的人類(lèi)同源基因?yàn)榉伟┺D(zhuǎn)移相關(guān)基因LCMR1[1]。目前，MED19基因在很多腫瘤組織中被發(fā)現(xiàn)，如肺癌、胃癌、大腸癌和膀胱癌等。研究發(fā)現(xiàn)，MED19基因與胃癌的細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和TNM分期有關(guān)[2]。本研究通過(guò)MED19基因靶向RNA干擾重組慢病毒對(duì)體內(nèi)胃癌細(xì)胞的干預(yù)，觀察其治療效果，希望MED19基因成為一個(gè)新的腫瘤治療靶向因子。

1 材料與方法

1.1 材料

SGC7901胃癌細(xì)胞株，由中科院上海生化細(xì)胞所提供。

36只BALB/C‐nu/nu裸鼠，購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，性別、鼠齡及體重間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，飼養(yǎng)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部SPF級(jí)屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK（吉）2007‐0011]，喂養(yǎng)環(huán)境、溫度和條件均符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞懸液的制備SGC7901胃癌細(xì)胞株，經(jīng)復(fù)蘇和傳代后置入培養(yǎng)瓶中備用。將細(xì)胞株分3組：①正常培養(yǎng)的SGC7901胃癌細(xì)胞，不用病毒顆粒轉(zhuǎn)染，作為空白對(duì)照，以BC標(biāo)記，為BC組；②用shRNA慢病毒顆粒感染，呈陰性，作為陰性對(duì)照，以NC標(biāo)記，為NC組；③用MED19基因的shRNA慢病毒感染，呈陽(yáng)性，作為病毒干擾，以VⅠ標(biāo)記，為VⅠ組（MED19基因的shRNA慢病毒載體購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司）。經(jīng)胰酶消化后，制成細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，根據(jù)感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOⅠ）=10，分別向NC組和VⅠ組加入LV-NC和LV-MED19基因的shRNA慢病毒顆粒，同時(shí)設(shè)經(jīng)胰酶消化后的空白對(duì)照，以CON標(biāo)記，繼續(xù)培養(yǎng)。感染72 h后觀察慢病毒感染率，以50%為界限，若感染率≥50%，繼續(xù)培養(yǎng)；若＜50%，需要重新進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。感染5 d后，各組細(xì)胞的感染率均＞90%，滿足實(shí)驗(yàn)需要。培養(yǎng)期間，細(xì)胞正常傳代。細(xì)胞活力≥95%，采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法，將細(xì)胞離心2 min，在1000 r/min的條件下將培養(yǎng)基棄除。將無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered so‐lution，PBS）溶液加入細(xì)胞內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×107/ml，制備成動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要的細(xì)胞懸液。將懸液加入1.5 ml的EP管中，置于4℃冰上待用。

1.2.2 人胃癌裸鼠皮下種植瘤模型的建立36只裸鼠經(jīng)專(zhuān)業(yè)人員飼養(yǎng)1周以上，隨機(jī)分為3組，每組12只。3組分別以BC、NC和VⅠ標(biāo)記，分別接種BC、NC、VⅠ3組細(xì)胞。建立模型的過(guò)程如下：按照組別將各組裸鼠分別移至超凈臺(tái)，用碘伏消毒待接種的部位，混勻細(xì)胞懸液。選擇裸鼠右側(cè)腋下皮下為接種部位，抽取0.2 ml細(xì)胞懸液接種，形成約3 mm皮丘，注射后局部壓迫片刻。觀察成瘤情況，每日觀察內(nèi)容：瘤體生長(zhǎng)情況、是否感染、出瘤時(shí)間及腫瘤是否自然消退。腫瘤直徑≥3 mm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。成瘤體積（mm3）=腫瘤長(zhǎng)徑（mm）×腫瘤橫徑（mm）×腫瘤橫徑（mm）/2，取平均值。成瘤35 d后，采用脫頸法將全部裸鼠處死，沿包膜完整分離瘤體，用分析天平精確稱(chēng)取腫瘤的質(zhì)量，將腫瘤以10%甲醛固定，石蠟切片，蘇木精‐伊紅（hematoxy‐lin‐eosin，HE）染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)-資料以率（%）表示，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK‐q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞后的生長(zhǎng)情況

裸鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞后，各組瘤體生長(zhǎng)狀態(tài)均良好。接種后，BC組和NC組裸鼠的中位成瘤時(shí)間約為7 d，VⅠ組裸鼠的中位成瘤時(shí)間約為9 d。

成瘤的標(biāo)準(zhǔn)為接種部位皮下出現(xiàn)小結(jié)節(jié)。BC組和NC組裸鼠全部長(zhǎng)出腫瘤，成瘤率為100%；VⅠ組10只裸鼠長(zhǎng)出腫瘤，成瘤率為83.3%。全部裸鼠的總成瘤率為94.4%。

2.2 裸鼠皮下接種腫瘤的體積變化

隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，全部裸鼠的腫瘤體積逐漸增大，未出現(xiàn)自發(fā)消退現(xiàn)象。每7天測(cè)量1次腫瘤體積并記錄。接種21 d后，BC組和NC組裸鼠的成瘤體積明顯大于VⅠ組。隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，VⅠ組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯低于BC組和NC組，詳見(jiàn)圖1。

圖1 腫瘤的生長(zhǎng)曲線

2.3 瘤體的鏡下觀察結(jié)果

對(duì)3組瘤體行常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察可以確認(rèn)腫瘤的病理類(lèi)型為低分化胃腺癌，VⅠ組癌組織在光鏡下（×400）可以明顯觀察到細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，表現(xiàn)為細(xì)胞縮小、皺縮及細(xì)胞呈現(xiàn)片狀壞死等征象；而B(niǎo)C組和NC組癌組織在光鏡下不顯示或很少顯示上述變化。（圖2）

圖2 各組離體瘤組織（HE染色，×400）

3 討論

MED19是2003年克隆的新基因，人類(lèi)同源基因?yàn)榉伟┺D(zhuǎn)移相關(guān)基因LCMR1[1]，已在很多腫瘤組織中被發(fā)現(xiàn)，如肺癌、胃癌、大腸癌和膀胱癌等。作為中介體的亞單位MED19（Rox3），最初在研究CYC7基因突變體中被發(fā)現(xiàn)，其無(wú)論是在轉(zhuǎn)錄激活還是轉(zhuǎn)錄抑制中均發(fā)揮了重要的作用。近年來(lái)，針對(duì)MED19基因的研究不斷增加，其功能不斷被揭示出來(lái)。相關(guān)研究表明，MED19基因的功能如下：①M(fèi)ED19基因突變可以抑制Gal4和Gcn4誘導(dǎo)的基因活化[3‐4]，引起一系列的效應(yīng)，如熱休克、葡萄糖抑制效應(yīng)和HO基因的阻遏作用消失[5‐7]；②MED19基因的剔除或缺失，可以引起一系列的基因表達(dá)量上升或下降[8]；③在中介體復(fù)合物各部分的內(nèi)在相互作用中，MED19起著十分重要的調(diào)控作用[9]；④在RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的神經(jīng)基因表觀沉默過(guò)程中，MED19/MED26在中介體復(fù)合物中發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用[10]；⑤在基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，中介體MED19發(fā)揮著重要的作用，其與細(xì)胞的生長(zhǎng)及周期調(diào)控有密切的關(guān)系。本研究在胃癌SGC‐7901細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分析了MED19基因在體內(nèi)的相關(guān)功能和機(jī)制。

目前，胃癌是世界上公認(rèn)的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，中國(guó)被認(rèn)為是胃癌的高發(fā)地區(qū)。癌癥的發(fā)生與諸多因素有關(guān)，其中癌基因的非正?；罨⒁职┗虻姆钦ＪЩ钆c癌癥的發(fā)生有密切的關(guān)系。如果可以找到所需要的沉默癌基因表達(dá)的小片段序列，通過(guò)RNAi技術(shù)，可能使其成為抑制胃癌的新靶點(diǎn)。在本研究的前期工作中[11]，成功地獲得了有效的MED19‐shRNA包裝病毒，在體外實(shí)驗(yàn)中成功感染SGC7901細(xì)胞后，其mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，獲得了預(yù)期結(jié)果，這證明可以利用RNAi沉默MED19基因且效果良好。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)下一步研究有一定的指導(dǎo)意義，如果可以觀察到體內(nèi)RNAi沉默MED19基因的效果，對(duì)是否可以找到胃癌治療的新靶點(diǎn)非常重要，是進(jìn)行更深一步研究的基礎(chǔ)；如果可以證明RNAi靶向沉默MED19基因后，瘤體的生長(zhǎng)速度和侵襲度明顯下降，可以大膽地假設(shè)針對(duì)MED19基因進(jìn)行干預(yù)可以為胃癌治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。本研究基于體外實(shí)驗(yàn)，利用裸鼠成功構(gòu)建胃癌體內(nèi)模型，通過(guò)分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，VⅠ組裸鼠的出瘤時(shí)間明顯長(zhǎng)于BC組和NC組，而出瘤后比較相同時(shí)間內(nèi)各組裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況，可以發(fā)現(xiàn)VⅠ組腫瘤體積小于BC組和NC組。這個(gè)結(jié)果與正在進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)所觀察到的沉默MED19的表達(dá)后腫瘤的生長(zhǎng)、增殖有明顯的抑制一致，說(shuō)明MED19基因靶向RNA干擾重組慢病毒對(duì)體內(nèi)胃癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，揭示了MED19基因沉默后可以明顯地影響胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期，這些為后續(xù)研究MED19基因在癌癥中的作用機(jī)制和臨床研究打下了基礎(chǔ)。

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