吳茂迪，宋星桔，閆　敏，陽愛國，郭　莉，王　凝，謝　躍，古小彬，楊光友*

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2. 四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，成都 610041)

細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)的中絳期幼蟲(細(xì)粒棘球蚴)寄生于人和動(dòng)物的肝和肺等組織器官引起細(xì)粒棘球蚴病(cystic echinococcosis, 又稱囊性包蟲病)，是一種重大的人獸共患病[1-4]，該病呈世界性分布，我國是高發(fā)國家之一，主要在內(nèi)蒙古、新疆、青海、西藏、寧夏、四川、甘肅等省份流行[5]。包蟲病嚴(yán)重危害人體健康，同時(shí)給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，給人類帶來許多公共衛(wèi)生問題。我國已將該病列為《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃》(2012—2020年)優(yōu)先防治和重點(diǎn)防范的動(dòng)物疫病。

半胱氨酸蛋白酶抑制劑是半胱氨酸蛋白酶類可逆性緊密結(jié)合抑制劑。根據(jù)半胱氨酸蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)將其分為4個(gè)大家族，即Ⅰ型(the stefin)、Ⅱ型(the cystatin)、Ⅲ型(the kininogen)和Ⅳ型(the fetuin)[6-7]。其中，Ⅱ型cystatin屬于分泌性蛋白，在N末端有信號(hào)肽序列，該家族蛋白一般分泌到細(xì)胞外參與外源蛋白的調(diào)節(jié)[8]。在對(duì)寄生性線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑的研究中發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)宿主具有干預(yù)抗原呈遞過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子生成，活化巨噬細(xì)胞等作用[9-11]。因此，它在線蟲逃避宿主免疫應(yīng)答和適應(yīng)寄生生活中發(fā)揮著重要作用[12]。在絳蟲上，李君君等[13]對(duì)豬帶絳蟲的cystatin進(jìn)行了三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)域能與半胱氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)結(jié)合來發(fā)揮抑制作用。

目前有關(guān)于細(xì)粒棘球絳蟲cystatin的研究，尚未見有報(bào)道。本研究對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Eg-cystatin)的基本特性進(jìn)行分析與蟲體組織定位，并通過間接ELISA初步評(píng)價(jià)其診斷價(jià)值，為今后該蛋白質(zhì)的功能研究提供重要資料。

1　材料與方法

1.1　蟲體與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

細(xì)粒棘球蚴包囊來自于自然感染的綿羊肝，樣本采自青海省的某屠宰場。在無菌條件下，使用一次性注射器反復(fù)吹打后抽取包囊囊液，并分離生發(fā)層，囊液經(jīng)3 000 r·min-1離心5 min，用滅菌生理鹽水和PBS分別洗滌3次，獲得細(xì)粒棘球蚴原頭蚴。成蟲由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲病研究中心提供。兩只9周齡(2.5 kg)雌性新西蘭大白兔購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2　生物信息學(xué)分析

Eg-cystatin全長核酸序列下載自細(xì)粒棘球絳蟲基因組數(shù)據(jù)庫GeneDB (EgrG_000849600) (http://www.genedb.org/)。以在線軟件SignalP 4.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和ExPaSy (http://www.expasy.org/) 分別對(duì)Eg-cystatin的信號(hào)肽、理化參數(shù)、保守結(jié)構(gòu)域、糖基化和磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。以推導(dǎo)出的氨基酸序列找出同源序列，并用Clustal X 1.83 軟件進(jìn)行比對(duì)。

用DNAMAN比較同源基因的相似性。

用MEGA 5.05軟件采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.3　Eg-cystatin的克隆、表達(dá)與純化

以除去信號(hào)肽序列的Eg-cystatin序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(上游5′-CCGGAATTCAGACAGCAAGAGCGCAGCGT-3′，下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；下游5′-ACGCGTCGACTAGGGCTGTGGGGTCTTGAT-3′，下劃線為SalⅠ酶切位點(diǎn))。從cDNA中擴(kuò)增出Eg-cystatin序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pET28a(+)質(zhì)粒上并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中。細(xì)胞在1 mmol·L-1IPTG下37 ℃誘導(dǎo)5 h，離心收集菌體沉淀，用超聲破碎儀超聲裂解重組菌。重組蛋白質(zhì)以Ni2+親和層析的方法進(jìn)行純化。純化后的蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白試劑盒進(jìn)行測定。

1.4　血清

24份健康綿羊血清采自細(xì)粒棘球蚴病的非流行區(qū)，并通過剖檢確定無帶科絳蟲感染；24份自然感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊血清、12份自然感染腦多頭蚴的綿羊血清、3份自然感染細(xì)頸囊尾蚴綿羊血清以及7份自然感染細(xì)頸囊尾蚴山羊血清均采自四川省。以上陽性血清均經(jīng)剖檢確認(rèn)，為單一的帶科絳蟲感染。

1.5　兔抗 rEg-cystatin-IgG

將純化后的rEg-cystatin蛋白分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按照 1∶1 比例混合制備乳劑苗，對(duì)兩只新西蘭兔進(jìn)行三次皮下注射免疫，每次免疫間隔兩周，第一次用弗氏完全佐劑和200 μg重組蛋白質(zhì)皮下注射免疫，后兩次均用弗氏不完全佐劑和200 μg重組蛋白質(zhì)皮下注射免疫。收集血清，用Hitrap蛋白A親和層析純化。

1.6　免疫印跡和免疫熒光定位

重組蛋白質(zhì)與原頭蚴裂解液分別進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳，再將凝膠分別轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶封閉后，分別以綿羊陽性、陰性血清和兔高免血清、對(duì)照血清對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育；以重組蛋白質(zhì)高免血清和對(duì)照血清對(duì)原頭蚴裂解液進(jìn)行孵育。經(jīng)洗滌后，以HRP標(biāo)記的兔抗綿羊二抗對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育；并以HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗對(duì)原頭蚴裂解產(chǎn)物進(jìn)行孵育。最后在顯色底物作用下進(jìn)行顯色觀察。

取原頭蚴、生發(fā)層和成蟲制備切片，經(jīng)脫蠟、脫水處理后，用重組蛋白質(zhì)高免血清4 ℃孵育過夜。反復(fù)洗滌切片后，以FITC標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗對(duì)蟲體進(jìn)行顯色，并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.7　ELISA的建立和評(píng)估

用建立的間接ELISA分別對(duì)7份山羊細(xì)頸囊尾蚴陽性血清、3份綿羊細(xì)頸囊尾蚴陽性血清以及12份綿羊腦多頭蚴血清進(jìn)行檢測，檢測其交叉反應(yīng)。

臨床檢測用24份陰性血清建立的間接ELISA方法分別對(duì)24份細(xì)粒棘球蚴病陰性綿羊血清和24份細(xì)粒棘球蚴病陽性綿羊血清進(jìn)行，檢測臨界值判斷該方法的可靠性。按照特異性=真陰性血清數(shù)/(真陰性血清數(shù)+假陽性血清數(shù))；敏感性=真陽性血清數(shù)/(真陽性血清數(shù)+假陰性血清數(shù))；符合率=(真陽性血清數(shù)+真陰性血清數(shù))/(真陽性血清數(shù)+真陰性血清數(shù)+假陽性血清數(shù)+假陰性血清數(shù))，計(jì)算出特異性、敏感性及符合率。所有血清樣品評(píng)價(jià)批間變異和批內(nèi)變異的變異系數(shù)(CV)。每個(gè)樣品包被三個(gè)板檢測批間CV，并在每個(gè)板內(nèi)進(jìn)行三個(gè)重復(fù)檢測批內(nèi)CV。

2　結(jié)　果

2.1　Eg-cystatin基因的擴(kuò)增與生物信息學(xué)分析

Eg-cystatin(EgrG_000849600)基因全長825 bp，編碼274個(gè)氨基酸，預(yù)測相對(duì)分子質(zhì)量為30.8 ku。經(jīng)氨基酸序列預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在第18和第19個(gè)氨基酸之間有信號(hào)肽存在，切除信號(hào)肽后長度為256個(gè)氨基酸，預(yù)測相對(duì)分子質(zhì)量為28.9 ku，等電點(diǎn)為5.7，無糖基化位點(diǎn)，存在磷酸化位點(diǎn)。氨基酸序列分析顯示Eg-cystatin含有cystatin結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域包括Q-X-V-X-G保守序列，靠近N端的甘氨酸殘基，PW發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。序列比對(duì)結(jié)果顯示，Eg-cystatin與多房棘球絳蟲cystatin相似性最高，達(dá)到80.66%，與豬帶絳蟲、牛帶絳蟲以及亞洲帶絳蟲的cystatin相似性為72.20%～75.91%，與馬來絲蟲、日本血吸蟲、剛地弓形蟲相似性極低(圖1)。進(jìn)化樹結(jié)果顯示，在蠕蟲上，Eg-cystatin與多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis)、微小膜殼絳蟲(Hymenolepisnana)、豬帶絳蟲(Taeniasolium)、牛帶絳蟲(Taeniasaginata)以及亞洲帶絳蟲(Taeniaasiatica)等寄生蟲的cystatin屬于同一支(圖2)。

2.2　重組蛋白質(zhì)的表達(dá)與免疫印跡

除去信號(hào)肽的Eg-cystatin蛋白質(zhì)在SDS-PAGE下顯示為單一條帶，大小約為33 ku，符合預(yù)期大小[加上pET28a (+)質(zhì)粒所表達(dá)的His標(biāo)簽蛋白]。免疫印跡顯示，rEg-cystatin能被兔抗rEg-cystatin-IgG和細(xì)粒棘球蚴病陽性綿羊血清識(shí)別(圖3)，且為單一條帶，陰性對(duì)照無條帶，說明Eg-cystatin具有較好的免疫原性。以兔抗rEg-cystatin-IgG識(shí)別原頭蚴粗蛋白質(zhì)提取液，顯示有單一條帶，大小與天然蛋白質(zhì)相近(30.8 ku)。

2.3　Eg-cystatin在細(xì)粒棘球絳蟲各生活史階段的定位

利用免疫熒光技術(shù)，以兔抗rEg-cystatin抗體來測定Eg-cystatin在細(xì)粒棘球絳蟲各生活史階段的定位。結(jié)果顯示，Eg-cystatin分布于原頭蚴的表皮以及頂突鉤上，廣泛分布于成蟲蟲體的內(nèi)部，蟲卵與表皮上也有少量分布，生發(fā)層廣泛分布(圖4)。

Q-X-V-X-G活性位點(diǎn)用黑字綠底表示。N端保守的甘氨酸殘基用白字藍(lán)底表示。PW發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)用黑字紅底表示。信號(hào)肽用藍(lán)色括弧表示。GenBank登陸號(hào)：E.granulosus cystatin (GenBank: EUB63448.1), E. multilocularis cystatin (GenBank: CDS40893.1), T.solium cystatin (GenBank: AIM55117.1), T.saginata cystatin (GenBank: AIM55120.1), T.asiatica cystatin (GenBank: AIM55123.1), H.microstoma cystatin (GenBank: CDS28976.1), B.malayi cystatin (GenBank: XP_001895476.1), S.japonicum cystatin (GenBank: ACU68954.1), and T.gondii cystatin (GenBank: ABR26639.1)The Q-X-V-X-G motif is shown in black letters with a green background. A conserved glycine residue in the N-terminal region is marked as a white letter on a blue background. The P-W hairpin loop in the C-terminal region is marked in black letters with a red background. The signal peptide is marked with the blue bracket. GenBank accession numbers: Echinococcus granulosus cystatin (GenBank: EUB63448.1), Echinococcus multilocularis cystatin (GenBank: CDS40893.1), Taenia solium cystatin (GenBank: AIM55117.1), Taenia saginata cystatin (GenBank: AIM55120.1), Taenia asiatica cystatin (GenBank: AIM55123.1), Hymenolepis microstoma cystatin (GenBank: CDS28976.1), Brugia malayi cystatin (GenBank: XP_001895476.1), Schistosoma japonicum cystatin (GenBank: ACU68954.1), and Toxoplasma gondii cystatin (GenBank: ABR26639.1)圖1　Eg-cystatin氨基酸序列比對(duì)Fig.1　Amino acid sequence analysis of Eg-cystatin

2.4　ELISA

間接ELISA結(jié)果顯示，抗原最佳質(zhì)量濃度為0.8 μg·孔-1，最佳血清稀釋度為1∶320。在最適濃度下，得出臨界值為0.427。用建立的間接ELISA分別對(duì)綿羊抗腦多頭蚴血清和山羊抗細(xì)頸囊尾蚴陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示有8個(gè)血清與綿羊腦包蟲血清有交叉反應(yīng)，有7個(gè)血清與細(xì)頸囊尾蚴有交叉反應(yīng)，因此，其存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng)。用24份綿羊細(xì)粒棘球蚴病陽性血清和24份陰性血清對(duì)建立的間接ELISA方法進(jìn)行臨床檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5個(gè)假陽性和4個(gè)假陰性，特異性為79.1%，敏感性為83.3%，符合率僅為81.25%(圖5)。批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，板內(nèi)的變異系數(shù)介于1.332%～1.589%，平均值為1.495%，板間變異系數(shù)介于2.318%～4.095%，平均值為3.282%。板內(nèi)與板間系數(shù)均<10%，表明該方法重復(fù)性好。

3　討　論

半胱氨酸蛋白酶抑制劑是一類在生物體內(nèi)廣泛存在的能夠可逆性地抑制半胱氨酸蛋白酶的抑制劑超家族[16]。半胱氨酸蛋白酶抑制劑不僅能特異性抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，而且是寄生蟲產(chǎn)生的重要免疫調(diào)節(jié)分子[12]。近年來，cystatin備受研究者的關(guān)注，在寄生蟲領(lǐng)域中，研究得比較深入的是有關(guān)線蟲cystatin調(diào)控宿主的免疫反應(yīng)方面[9-12]。此外，日本血吸蟲cystatin被證明有誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)TNF-α和IL-6產(chǎn)生的作用[17]。華支睪吸蟲的stefin位于腸上皮，并發(fā)現(xiàn)其能調(diào)節(jié)和加工組織蛋白酶F的活性，防止內(nèi)源性半胱氨酸蛋白酶對(duì)寄生蟲造成傷害[18]； cystatin也發(fā)現(xiàn)存在于大片吸蟲雄蟲的睪丸、射精管及精液中，與射精和受精過程相關(guān)，這表明半胱氨酸蛋白酶抑制劑在大片吸蟲的生殖周期中有重要的調(diào)節(jié)作用[19]。

物種名稱后為該序列的GenBank登錄號(hào)GenBank accessing numbers were given after the species name圖2　Eg-cystatin基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ樹)Fig.2　The phylogenetic (neighbor-joining) tree of Eg-cystatin

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.加IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌BL21表達(dá)重組Eg-cystatin；2.純化后的重組Eg-cystatin；3.重組Eg-cystatin與高免血清孵育；4. 重組Eg-cystatin與對(duì)照兔血清孵育；5. 重組Eg-cystatin與自然感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊血清孵育；6. 重組Eg-cystatin與健康羊血清孵育；7.原頭蚴裂解液與兔重組Eg-cystatin高免血清孵育；8. 原頭蚴裂解液與對(duì)照兔血清孵育M. Protein molecular weight marker; 1. Lysate of IPTG-induced E. coli BL21 (DE3) expressing recombinant E. granulosus cystatin (rEg-cystatin); 2. Purified rEg-cystatin; 3. Purified rEg-cystatin probed with anti-rEg-cystatin rabbit serum; 4. Purified rEg-cystatin probed with native rabbit serum; 5. Purified rEg-cystatin probed with the serum of E. granulosus infected sheep; 6. Purified rEg-cystatin probed with native sheep serum; 7. Endogenous Eg-cystatin from protoscoleces (PSCs) probed with anti-Eg-cystatin rabbit serum; 8. The total protein extract of PSCs probed with native rabbit serum圖3　SDS-PAGE鑒定及Western blot分析Fig.3　SDS-PAGE and Western blot analysis

Teg. 表皮；IB. 蟲體內(nèi)部。標(biāo)尺：50 μmTeg. Tegument; IB. Inner body. Scale bars: 50 μm圖4　Eg-cystatin蛋白在各時(shí)期蟲體上的免疫熒光定位Fig.4　Immunofluorescence localization of Eg-cystatin in different stages of E. granulosus

A.ELISA進(jìn)行交叉反應(yīng)分析；B. ELISA進(jìn)行臨床試驗(yàn)。實(shí)線代表cut-off值為0.427A. The cross-reaction of the iELISA; B. Clinical trial of the iELISA. The bold horizontal line indicates the cut-off value, which was 0.427圖5　重組Eg-cystatin間接ELISA分析Fig.5　Indirect ELISA using rEg-cystatin as the antigen

本研究從細(xì)粒棘球絳蟲中擴(kuò)增出cystatin，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)的預(yù)測與分析，發(fā)現(xiàn)Eg-cystatin有信號(hào)肽，提示該蛋白很可能在細(xì)胞外實(shí)現(xiàn)其抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，同時(shí)可能發(fā)揮重要的調(diào)控功能，這與先前報(bào)道的大多數(shù)cystatin家族蛋白屬于分泌蛋白結(jié)果相一致[20]。序列分析顯示Eg-cystatin包含典型的半胱氨酸蛋白酶抑制劑保守活性位點(diǎn)：(1)PW位點(diǎn);(2)Q-X-V-X-G區(qū)域;(3)靠近N端的G位點(diǎn)。二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)Eg-cystatin都具有保守的中心1個(gè)α-螺旋，周圍環(huán)繞5個(gè)反平行的β折疊的片層結(jié)構(gòu)區(qū)，這幾個(gè)保守結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成一個(gè)楔形結(jié)構(gòu)，與蛋白酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，形成酶-抑制劑復(fù)合物從而發(fā)揮抑制活性。A. J. Guo[8]對(duì)蠕蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域進(jìn)化分析，結(jié)果顯示絳蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑獨(dú)立形成一個(gè)分支，暗示絳蟲的cystatin可能在演化過程中已經(jīng)形成了一個(gè)新的進(jìn)化支，這與本研究中進(jìn)化樹分析的結(jié)果一致。以上結(jié)果均說明Eg-cystatin屬于cystatin家族，為深入了解Eg-cystatin的功能奠定了基礎(chǔ)。

本研究通過對(duì)Eg-cystatin進(jìn)行免疫熒光定位，發(fā)現(xiàn)在成蟲和幼蟲時(shí)期均有表達(dá)，提示該基因與蟲體生命活動(dòng)息息相關(guān)。絳蟲直接通過皮層吸收營養(yǎng)物質(zhì)[21]，Eg-cystatin定位于原頭蚴的表皮以及頂突鉤上，推測其可能與原頭蚴的營養(yǎng)物質(zhì)吸收有關(guān)。有研究報(bào)道cystatin在寄生蟲逃避宿主免疫應(yīng)答和適應(yīng)寄生生活中起著重要的作用[9-12]，由于原頭蚴入侵終末宿主后通過頂突上的鉤吸附在宿主腸壁上，因此原頭蚴可能通過分泌cystatin調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)而發(fā)揮免疫逃避作用。同時(shí)，宿主腸道內(nèi)含有大量的消化酶，免疫組化結(jié)果顯示cystatin在細(xì)粒棘球絳蟲的成蟲表皮及內(nèi)部均有廣泛分布，該蛋白質(zhì)可能與抑制宿主蛋白酶參與免疫反應(yīng)及保護(hù)蟲體免受宿主消化酶的消化有關(guān)。

目前可用于家畜包蟲病免疫學(xué)診斷的抗原研究尚有限[22-24]，篩選敏感、特異、易于生產(chǎn)的診斷抗原是目前包蟲病防控的重點(diǎn)方向之一[22]。從包囊液提取的8-kDa抗原B具有很高的靈敏度和特異性(>90%)[25-26]，但是該天然抗原很難純化以及規(guī)?；拇罅可a(chǎn)[27]。而重組抗原具有特異性強(qiáng)、易純化和成本低等優(yōu)點(diǎn)[28]。目前已報(bào)道重組抗原Eg-DHFR、Eg-Grx1的特異性與敏感性較高，交叉反應(yīng)率低，可作為診斷抗原候選[29-30]。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)一些重組蛋白抗原的靈敏度與特異性較低，不適合作為診斷抗原[31-32]。雖然Eg-cystatin屬于分泌蛋白，但在本試驗(yàn)中經(jīng)間接ELISA評(píng)估，其特異性為79.1%，敏感性為83.3%，同山羊細(xì)頸囊尾蚴病血清、綿羊細(xì)頸囊尾蚴病血清和綿羊腦包蟲病血清交叉反應(yīng)率為68.2%。因此，提示rEg-cystatin蛋白不適合作為綿羊細(xì)粒棘球蚴病的診斷抗原。

4　結(jié)　論

原核表達(dá)細(xì)粒棘球絳蟲Eg-cystatin重組蛋白。該蛋白質(zhì)含有一個(gè)N端信號(hào)肽以及cystatin結(jié)構(gòu)域，是典型的2型半胱氨酸蛋白酶抑制劑，進(jìn)化樹分析顯示Eg-cystatin屬于絳蟲cystatin Ⅱ型。該蛋白質(zhì)主要分布在原頭蚴的表皮和頂突鉤，生發(fā)層，成蟲蟲體內(nèi)部和蟲卵。間接ELISA評(píng)估Eg-cystatin蛋白不適合作為綿羊細(xì)粒棘球蚴病的診斷抗原候選。

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