劉理想，孫大明，毛勝勇，劉軍花

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，南京 210095)

胰高血糖素樣肽-2(Glucagon-like peptide-2，GLP-2)是由33個氨基酸組成，腸L內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的一種腸上皮特異性生長因子，其分泌受腸道營養(yǎng)素[1]和營養(yǎng)水平[2]的調(diào)控。GLP-2的功能包括促進(jìn)腸道發(fā)育、增強(qiáng)腸道屏障功能、增加血液流量及抗炎癥作用等[3]，而其中最主要的功能就是特異性地促進(jìn)腸黏膜生長與損傷后修復(fù)[4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，GLP-2可通過抑制隱窩細(xì)胞凋亡、促進(jìn)隱窩細(xì)胞增殖來增加絨毛高度和隱窩深度，從而刺激小腸上皮的生長和發(fā)育[5]。對斷奶仔豬腸上皮細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的二肽基肽酶Ⅳ能夠促進(jìn)GLP-2對細(xì)胞增殖、代謝和細(xì)胞完整性的作用效果[6]。

基于GLP-2在維持其他物種(人、豬、大鼠和小鼠等)腸道穩(wěn)態(tài)中的重要作用，近年來人們開始重視GLP-2在反芻動物腸道發(fā)育中的作用。但相較人及單胃動物上的研究，GLP-2在反芻動物上的研究才剛剛起步。較早的研究發(fā)現(xiàn)，在代乳料和開食料中添加丁酸鈉可以提高犢牛頸靜脈血漿中GLP-2的濃度[7]。近年來有研究在奶牛所有胃腸道組織都檢測到胰高血糖素GCG(GLP-2的前體物質(zhì))及GLP-2受體(GLP-2R)，尤其在小腸細(xì)胞中高度表達(dá)，證實(shí)了在反芻動物胃腸道中同樣存在GLP-2信號系統(tǒng)，同時也發(fā)現(xiàn)，日糧能量水平的增加可提高小腸GLP-2的分泌量，從而促進(jìn)小腸的發(fā)育，并提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT-2的表達(dá)量[8]。本實(shí)驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，皮下注射GLP-2可以促進(jìn)犢牛小腸黏膜的生長及血液的流通[9]。近年來的研究結(jié)果也證實(shí)，GLP-2可作為藥物通過改善小腸黏膜細(xì)胞自我更新來緩解犢牛腹瀉[10]。最新研究進(jìn)展表明，甜味素可以通過刺激GLP-2分泌從而促進(jìn)犢牛小腸上皮的生長發(fā)育[11]?；谝陨涎芯勘尘翱梢钥闯?，GLP-2系統(tǒng)存在于反芻動物腸道中，并且其可促進(jìn)其腸道發(fā)育，但其中所涉及的分子機(jī)制并不清楚。

單胃動物上的大量研究表明，GLP-2與小腸上皮的GLP-2R結(jié)合，刺激IGF-1的分泌，接著IGF-1結(jié)合IGF-1R，激活相應(yīng)的信號通路，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和相應(yīng)的蛋白激酶來加快細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖[12]。反芻動物同樣存在GLP-2系統(tǒng)，但其促進(jìn)小腸發(fā)育的機(jī)制是否與單胃動物一致并不清楚。因此，本研究采用體外注射GLP-2試驗，對羔羊小腸上皮Cyclins、CDKs、GCG、GLP-2R、IGF-1和IGF-1R mRNA表達(dá)進(jìn)行研究。研究結(jié)果將對深入認(rèn)識GLP-2調(diào)節(jié)羔羊小腸發(fā)育的分子機(jī)制具有重要意義。

1　材料與方法

1.1　試驗設(shè)計與動物飼養(yǎng)

試驗選擇10只體況良好，胎次一致，體重相近的新生羔羊(湖羊)，隨機(jī)分為兩組，每組5只。GLP-2組按50 μg·kg-1BW，每天分2次皮下注射GLP-2，間隔12 h, 連續(xù)注射14 d。對照組注射相應(yīng)體積的0.5%牛血清白蛋白(BSA)生理鹽水，注射時間同GLP-2組。牛血清白蛋白按1∶200的比例溶解在生理鹽水中，配置成0.5%的BSA生理鹽水溶液，GLP-2溶解于0.5%的BSA生理鹽水溶液(0.4 mg·mL-1)，現(xiàn)配現(xiàn)用。GLP-2由南京肽業(yè)生物科技有限公司合成，BSA購自南京建成生物有限公司。10日齡時，羔羊開始自由采食開食料、苜蓿(18.09%粗蛋白, 26.06%粗纖維)和燕麥草(10.05%粗蛋白, 28.71%粗纖維)。試驗期間，自由哺乳和飲水，每周最后一天于晨飼開食料前稱量羔羊體重。羔羊28日齡時，對照組和GLP-2組分別皮下注射BSA和GLP-2。試驗開始前，兩組羔羊的體重沒有顯著差異((6.18±0.47) kgvs. (5.80±0.26) kg,P=0.504)。試驗開食料參考NRC(2007)[13]建議的綿羊羔羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，開食料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1開食料組成與營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

Table1Ingredientandnutrientlevelsofthestarterdiet(drymatterbasis)

%

1.每千克預(yù)混料提供：維生素A 500 000 IU，維生素D 50 000 IU，維生素E 2 000 IU，F(xiàn)e 3.0 g，Zn 5.0 g，Cu 0.5 g，Mn 3.0 g，Co 0.1 g，I 50 mg，Se 40 mg；2.該數(shù)值是基于NRC(2007)[13]數(shù)據(jù)庫的計算值

1. Per kg premix contains: vitamin A 500 000 IU, vitamin D 50 000 IU, vitamin E 2 000 IU, Fe 3.0 g, Zn 5.0 g, Cu 0.5 g, Mn 3.0 g, Co 0.1 g, I 50 mg, Se 40 mg;2. The value is analyzed based on database of the NRC (2007)[13]

1.2　樣品采集

羔羊42日齡時，第一次注射2 h后進(jìn)行屠宰，屠宰前用含40單位肝素鈉的采血管采集頸靜脈血，于4 ℃ 3 000 r·min-1離心15 min后收集血漿，之后將其儲存在-20 ℃，待測血常規(guī)。屠宰后立即收集有代表性的瘤胃內(nèi)容物(至少200 mL)，四層無菌紗布過濾后立即測定pH，同時取過濾后的瘤胃液10 mL,分裝于2個5 mL的離心管，-20 ℃保存，待測揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度。屠宰后5 min之內(nèi)，將消化道分離稱量各器官重(瘤胃、瓣胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸)，采集十二指腸、空腸及回腸組織在冰的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)里清洗3次，將其組織剪成0.5 cm × 0.5 cm的小碎塊裝在2 mL的凍存管里置于液氮中保存，用于后續(xù)RNA的提取。

1.3　羔羊瘤胃及血液生理參數(shù)測定

用便攜式pH計 (HI 9024C; HANNA Instruments，美國) 當(dāng)場測定瘤胃液pH。利用氣相色譜儀 (GC-14B, 島津, 日本; 毛細(xì)管柱: 30 m×0.32 mm×0.25 mm 膜厚度) 測定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度，具體步驟參照秦為琳[14]的方法(柱溫為110 ℃，汽化室溫度為180 ℃，檢測器為180 ℃)。血漿葡萄糖濃度采用葡萄糖試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè))，利用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定。血漿GLP-2濃度根據(jù)GLP-2熒光酶免疫試劑盒(Phoenix Europe GmbH，德國)操作說明測定。血漿葡萄糖和GLP-2試劑盒的測量范圍分別是 3.89～6.11 mmol·L-1和0～10 000 pg·mL-1。

1.4　羔羊小腸上皮RNA的提取和cDNA的合成

取100 mg小腸上皮組織置于研缽中，倒入液氮快速充分研磨，按照Trizol試劑(TaKaRa，日本)的使用說明提取小腸上皮組織總RNA。提取的總RNA使用Nano Drop分光光度計檢測RNA的濃度和純度。所有樣品的吸收比例(OD260 nm/OD280 nm)都為1.8～2.0，證明RNA純度較高。用1.4%的瓊脂糖膠檢測RNA的完整性。將所有RNA濃度調(diào)整到1 μg·μL-1，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ煤蚪MRNA酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrismScript RT reagent kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本))進(jìn)行cDNA的合成。

1.5　引物的合成和實(shí)時定量PCR

利用Q5 Real-time PCR儀(Applied Biosystems，美國)對目的基因及內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行定量，GAPDH引物序列參照文獻(xiàn)[15]，實(shí)時定量PCR分析所用引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表2。用SYBR? Premix ExTaqTM(TaKaRa，日本)試劑盒進(jìn)行定量。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃，15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃，15 s。反應(yīng)體積20 μL：10 μL SYBR Premix ExTaq，0.4 μL ROX Reference Dye II, 10 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL，2 μL樣品cDNA，6.8 μL無菌水。所有樣品設(shè)3個重復(fù)。目的基因的相對表達(dá)量以管家基因GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行校正，數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT的方法。

表2本研究中所用引物序列

Table2Sequencesofprimerusedinthisstudy

基因名稱Genename基因IDGeneID引物序列(5'→3')Primersequence產(chǎn)物/bpProductsizeGCGNW_011943216.1F:CGGAAGAAGTCAACATCGTR:TAAAGTCTCGGGTAGCAAG119GLP-2RXM_004013306F:GGCCTACAGATACTGCCTGTCTR:GATGTAGTTACGTGTGCAGTGGA244IGF-1NM_001009774.3F:GCTCTCAACATCTCCCATCTCCR:CCCATTGCTTCTGAAGTGCAAA94IGF-1RNC_019475.2F:AGAAGATCACCATGAGCCGCR:TCACCGTCTTAATGGCCACC120CyclinANC_019478.2F:CTCTCCTATCACCGCCTGACR:CTTTGGGGTCCAAGTTCTGC144CyclinB1NM_001045872.1F:AGCGGATCCAAACCTTTGTAGTGR:CAATGAGGATGGCTCTCATGTTTC137CyclinD1NC_019478.2F:CCTGCCGTCCATGCGGAAR:GAACTTCACATCTGTGGCAC403CyclinEXM_015100542F:TGGCACCGATGTCTCTGTTCR:CCACACTGGCTTCTCACAGT114CDK1NM_174016.2F:CCAATAATGAAGTGTGGCCAGAAGR:AGAAATTCGTTTGGCAGGATCATAG164

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1.6　數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±SE)”表示。數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0中的獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行顯著性分析。采用GraphPad Prism 6.01 (www.graphpad.com) 軟件分析目的基因的mRNA表達(dá)量。P<0.05表示差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1　注射GLP-2對羔羊體重的影響

如圖1所示，與對照組相比，GLP-2組羔羊出生重(P=0.947)、7日齡重(P=0.809)、14日齡重(P=0.845)、21日齡重(P=0.704)、28日齡重(P=0.504)、35日齡重(P=0.306)和42日齡重(P=0.224)無顯著變化。

2.2　GLP-2對羔羊器官重量的影響

如表3所示，與對照組羔羊相比，GLP-2組羔羊空腸重(P=0.083)和回腸重(P=0.060)有升高的趨勢，而瘤胃濕重(P=0.906)、瘤胃干重(P=0.585)、瓣胃濕重(P=0.804)、瓣胃干重(P=0.464)、十二指腸重(P=0.272)、盲腸重(P=0.540)及結(jié)腸重(P=0.295)無顯著變化。

圖1　注射GLP-2對羔羊體重的影響Fig.1　The effect of GLP-2 injection on body weight of lambs

表3注射GLP-2對羔羊器官重量的影響(n=5)

Table3EffectsofGLP-2injectiononorganweightoflambs(n=5)

項目Item對照組ControlgroupGLP-2組GLP-2groupP值P-value瘤胃濕重/kgWetweightofrumen0.81±0.040.80±0.030.906瘤胃干重/gDryweightofrumen130.80±9.69138.80±10.170.585瓣胃濕重/gWetweightofomasum15.05±2.2116.32±4.410.804瓣胃干重/gDryweightofomasum8.80±2.0210.85±1.720.464十二指腸重/gDuodenumweight11.15±1.6313.61±1.300.272空腸重/gJejunumweight170.20±13.87215.20±17.970.083回腸重/gIleumweight287.40±13.26330.60±14.620.060盲腸重/gCecumweight52.45±10.8961.00±7.730.540結(jié)腸重/gColonweight141.40±8.75174.00±27.720.295

濕重. 屠宰分離器官后直接稱重；干重. 去除內(nèi)容物后稱重

The wet weight of organs are directly weighed after separation of the organs; The dry weight of organs are weighed after removing the contents

2.3　注射GLP-2對羔羊瘤胃和血液參數(shù)的影響

如表4所示，與對照組羔羊相比，GLP-2組羔羊顯著升高了血漿GLP-2濃度(P=0.025)；GLP-2組羔羊瘤胃pH(P=0.624)、總VFA濃度(P=0.331)、乙酸濃度(P=0.169)、丙酸濃度(P=0.427)、丁酸濃度(P=0.164)、其他VFA濃度(P=0.970)、乙丙酸比(P=0.855)及血漿葡萄糖濃度(P=0.842)相對于對照組沒有顯著變化。

表4注射GLP-2對羔羊瘤胃發(fā)酵和血液參數(shù)的影響(n=5)

Table4EffectsofGLP-2injectiononrumenfermentationandbloodparametersoflambs(n=5)

項目Item對照組ControlgroupGLP-2組GLP-2groupP值P-value瘤胃參數(shù)RuminalparameterpH5.65±0.205.50±0.240.624總揮發(fā)性脂肪酸/(mmol·L-1)TotalVFA100.82±2.59104.79±2.830.331乙酸/(mmol·L-1)Acetate53.77±1.2056.81±1.620.169丙酸/(mmol·L-1)Propionate32.91±1.9134.99±1.590.427丁酸/(mmol·L-1)Butyrate11.02±0.459.87±0.600.164其他揮發(fā)性脂肪酸/(mmol·L-1)OtherVFA3.13±0.163.12±0.210.970乙丙酸比Acetate/Propionate1.65±0.081.63±0.070.855血液參數(shù)Bloodparameter血漿葡萄糖/(mmol·L-1)Plasmaglucose4.26±0.184.31±0.100.842血漿GLP-2/(pg·mL-1)PlasmaGLP-240.44±2.9850.47±2.070.025

其他揮發(fā)性脂肪酸=異丁酸+戊酸+異戊酸

Other VFA=Isobutyrate + Valerate + Isovalerate

2.4　注射GLP-2對羔羊小腸上皮周期蛋白mRNA表達(dá)的影響

如圖2A所示，與對照組相比，GLP-2注射顯著升高了十二指腸上皮CyclinB1(P=0.001)、CyclinD1(P=0.044)、CDK1(P=0.028)及CDK6(P=0.016)的mRNA表達(dá)，而CyclinA、CyclinE1、CDK2和CDK4的mRNA表達(dá)沒有顯著變化(P>0.05)；GLP-2組空腸上皮CyclinA(P=0.028)、CyclinB1(P=0.016)、CDK1(P=0.013)、CDK4(P=0.023)和CDK6(P=0.028)mRNA表達(dá)顯著高于對照組，而CyclinD1、CyclinE1、CDK2的mRNA表達(dá)沒有顯著變化(P>0.05)；GLP-2注射顯著升高了回腸上皮CyclinA(P=0.025)、CyclinD1(P=0.001)、CDK2(P=0.013)、CDK4(P=0.020)的mRNA表達(dá)，而CyclinB1、CyclinE1、CDK1及CDK6的mRNA表達(dá)沒有顯著變化(P>0.05)。

2.5　注射GLP-2對羔羊小腸上皮GCG、GLP-2R、IGF-1及IGF-1R mRNA表達(dá)的影響

如圖2B所示，與對照組相比，GLP-2注射顯著升高了十二指腸上皮GCG(P=0.036)和IGF-1R(P=0.031)，空腸上皮GCG(P=0.049)、IGF-1(P=0.027)、IGF-1R(P=0.036)和GLP-2R(P=0.011)，回腸上皮GCG(P=0.025)、IGF-1(P=0.029)、IGF-1R(P=0.029)及GLP-2R(P=0.032)的mRNA表達(dá)；但對十二指腸上皮IGF-1(P=0.712)和GLP-2R(P=0.227)的mRNA表達(dá)沒有顯著影響。

3　討　論

本研究發(fā)現(xiàn)，皮下注射GLP-2并沒有影響羔羊的體重，與C.C.Taylor-Edwards等[9]在犢牛上的研究結(jié)果一致。這可能是由于試驗動物采食相同的日糧，能量攝入相同導(dǎo)致的。但相對于注射前，注射GLP-2后羔羊體重增加加快，一方面可能是由于GLP-2的作用，另一方面可能是受日齡增長的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，GLP-2并沒有影響羔羊除小腸以外其他胃腸道的重量。C.C.Taylor-Edwards等[8]在牛前胃組織中檢測到GCG和GLP-2R mRNA的表達(dá)較低，但在小腸組織中表達(dá)較高。皮下注射GLP-2可能會使GLP-2經(jīng)過血液循環(huán)到達(dá)瘤胃，但由于瘤胃上皮缺乏GLP-2R的介導(dǎo)，無法啟動相應(yīng)的下游通路，因此沒有影響羔羊瘤胃發(fā)育。同時發(fā)現(xiàn)，GLP-2注射也沒有顯著影響羔羊瘤胃發(fā)酵，這可能與兩組羔羊采食相同的日糧有關(guān)。本研究中一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，GLP-2注射對羔羊空腸和回腸重量有增加的趨勢，這與在非反芻動物中的發(fā)現(xiàn)類似[16]。這種增加可能是由于小腸隱窩細(xì)胞的增殖導(dǎo)致絨毛高度、隱窩深度和黏膜層的增加。GLP-2誘導(dǎo)小腸黏膜生長在非反芻動物中已有很多依據(jù)[17]，而在反芻動物中的研究相對較少。

圖2　注射GLP-2對羔羊小腸上皮細(xì)胞周期蛋白和GCG、GLP-2R、IGF-1和IGF-1R mRNA表達(dá)的影響Fig.2　The effect of GLP-2 injection on mRNA expression of small intestinal epithelial cell cycle proteins and GCG, GLP-2R, IGF-1, IGF-1R of lambs

基于上述結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)GLP-2注射對羔羊小腸重量有增加的趨勢，接下來，我們將進(jìn)一步研究GLP-2促進(jìn)羔羊小腸發(fā)育的分子機(jī)制。單胃動物上的許多研究表明，GLP-2具有促進(jìn)腸黏膜生長發(fā)育，腸上皮隱窩細(xì)胞增殖的作用[18-19]，而小腸上皮細(xì)胞增殖又與細(xì)胞周期的變化密切相關(guān)。細(xì)胞周期的推進(jìn)主要受細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)及其相關(guān)激酶(Cyclin dependent protein kinases, CDKs)的調(diào)控。細(xì)胞周期包括靜止期(G0期)、分裂間期(G1期、S期和G2期)和有絲分裂期(M期)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，CyclinD1與CDK4或CDK6形成的復(fù)合物對于G1階段至關(guān)重要[21]，而G1階段是真核生物細(xì)胞分裂周期中的關(guān)鍵步驟。本試驗中，GLP-2處理顯著升高了十二指腸上皮CyclinD1、CDK6的mRNA表達(dá)水平，空腸上皮CDK4及CDK6的mRNA表達(dá)水平和回腸上皮CyclinD1、CDK4的mRNA表達(dá)水平。這可能是由于注射GLP-2上調(diào)了小腸上皮CyclinD1、CDK4和CDK6的基因表達(dá)，使細(xì)胞周期G1期持續(xù)時間縮短，從而推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖。CyclinA在S和G2/M階段扮演著重要角色[22]。在S期，CyclinA-CDK2復(fù)合物通過關(guān)鍵DNA復(fù)制因子的磷酸化驅(qū)動染色體復(fù)制[23]。本研究中，GLP-2注射促使空腸上皮CyclinA和回腸上皮CyclinA、CDK2基因表達(dá)上調(diào)，這可能是GLP-2促進(jìn)了細(xì)胞周期過程中DNA復(fù)制。注射GLP-2使十二指腸上皮和空腸上皮CyclinB1和CDK1基因表達(dá)上調(diào)。據(jù)報道，哺乳動物CyclinB1-CDK1復(fù)合物在G2后期發(fā)揮著重要作用[24]。CyclinE1-CDK2可以促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期[25]，但本試驗中兩組小腸上皮的CyclinE1 mRNA的表達(dá)水平并沒有顯著差異。在一定程度上，小腸上皮細(xì)胞周期基因mRNA表達(dá)變化并不能完全反映細(xì)胞周期進(jìn)程變化。因此認(rèn)為，CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK4和CDK6是與腸道發(fā)育相關(guān)的重要基因。GLP-2可能通過上調(diào)這些基因的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)小腸的發(fā)育。

GLP-2的生物活性不僅與分泌量有關(guān)，也與血液中活性GLP-2的比例有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，體外注射GLP-2，升高了血漿GLP-2濃度，這表明體外注射GLP-2可能誘導(dǎo)了羔羊自身GLP-2的分泌。此外，外源GLP-2注射可提高羔羊小腸上皮GCG、GLP-2R的mRNA表達(dá)量，表明外源注射的GLP-2可能通過血液循環(huán)到達(dá)小腸，激活小腸GLP-2前體物質(zhì)(GCG)及其受體(GLP-2R)的表達(dá)。對小鼠的研究表明，GLP-2R主要在腸道的皮下肌成纖維細(xì)胞而非隱窩細(xì)胞表達(dá)[26]，這就暗示，GLP-2促進(jìn)腸道隱窩細(xì)胞增殖可能需要其他生長因子的介導(dǎo)。之后一系列的研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了以上假說。當(dāng)敲除小鼠的IGF-1R基因后，GLP-2促進(jìn)小腸隱窩細(xì)胞生長的作用被完全消除[27]。皮下肌成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗也發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加GLP-2使得IGF-1的分泌量顯著增加[28]。以上結(jié)果證實(shí)，GLP-2刺激小腸隱窩細(xì)胞的增殖需要通過IGF-1介導(dǎo)[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，注射GLP-2使羔羊十二指腸上皮IGF-1R，空腸和回腸上皮IGF-1、IGF-1R的mRNA表達(dá)上調(diào)。這可能是當(dāng)GLP-2與GLP-2R結(jié)合后，促進(jìn)了羔羊小腸上皮IGF-1的表達(dá)和分泌，這和P.E.Dube等[27]的研究結(jié)果一致。J.Jasleen等[29]報道，在體外試驗中，GLP-2處理腸上皮細(xì)胞系可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白A和D1的表達(dá)。E.E.Connor等[30]發(fā)現(xiàn)，牛的小腸中細(xì)胞周期蛋白D1和GLP-2R的表達(dá)呈正相關(guān)。許多研究證實(shí)，IGF-1能夠誘發(fā)CyclinD1表達(dá)的上調(diào)，之后與相應(yīng)的細(xì)胞周期依賴蛋白激酶CDK4和CDK6形成復(fù)合物而啟動細(xì)胞增殖[31-32]。但是，IGF-1與IGF-1R結(jié)合后，必須通過相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，才能發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的功能。外源GLP-2注射導(dǎo)致羔羊小腸上皮IGF-1及IGF-1R表達(dá)上調(diào)，并且與小腸上皮細(xì)胞周期蛋白表達(dá)變化一致。這一結(jié)果暗示，GLP-2調(diào)節(jié)羔羊小腸上皮細(xì)胞周期的作用可能與IGF-1信號通路存在一定關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果將對深入認(rèn)識GLP-2調(diào)節(jié)羔羊小腸發(fā)育的分子機(jī)制具有重要意義。

4　結(jié)　論

皮下注射GLP-2對羔羊體重、胃腸道各器官重量和瘤胃內(nèi)環(huán)境都沒有顯著影響，但空腸重和回腸重有增加的趨勢，同時，升高了血漿中GLP-2濃度，促進(jìn)了小腸上皮發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，外源注射GLP-2可促進(jìn)羔羊的小腸發(fā)育。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]FENG Y, DEMEHRI F R, XIAO W, et al. Interdependency of EGF and GLP-2 signaling in attenuating mucosal atrophy in a mouse model of parenteral nutrition[J].CellMolGastroenterolHepatol, 2017, 3(3): 447-468.

[2]CASTRO J J, MORRISON S Y, HOSSEINNI A, et al. Secretion of glucagon-like peptide-2 responds to nutrient intake but not glucose provision in milk-fed calves[J].JDairySci, 2016, 99(7): 5793-5807.

[3]DUBé P E, BRUBAKER P L. Frontiers in glucagon-like peptide-2: multiple actions, multiple mediators[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab, 2007, 293(2): E460-E465.

[4]KVIDERA S K, HORST E A, SANZ FERNANDEZ M V, et al. Characterizing effects of feed restriction and glucagon-like peptide 2 administration on biomarkers of inflammation and intestinal morphology[J].JDairySci, 2017, 100(11): 9402-9417.

[5]方媛媛. 胰高血糖素樣肽-2與膿毒癥腸道的保護(hù)[J]. 海南醫(yī)學(xué), 2017, 28(3): 456-458.

FANG Y Y. Gut protection of glucagon like peptide-2 for sepsis[J].HainanMedicalJournal, 2017, 28(3): 456-458. (in Chinese)

[6]賈剛, 鄧秋紅, 蔣榮川, 等. 胰高血糖素樣肽-2和二肽基肽酶Ⅳ抑制劑聯(lián)合使用對斷奶仔豬腸上皮細(xì)胞的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2017, 48(1): 99-107.

JIA G, DENG Q H, JIANG R C, et al. Effects of the combination of Glucagon-like peptide-2 and Dipeptidyl Peptidase-IV inhibitors on intestinal epithelial cells of weaned pigletsinvitro[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2017, 48(1): 99-107.(in Chinese)

[7]GORKA P, KOEALSKI Z M, PIETRZAK P, et al. Effect of sodium butyrate supplementation in milk replacer and starter diet on rumen development in calves[J].JPhysiolPharmacol, 2009, 60(S3): 47-53.

[8]TAYLOR-EDWARDS C C, BURRIN D G, MATTHEWS J C, et al. Expression of mRNA for proglucagon and glucagon-like peptide-2 (GLP-2) receptor in the ruminant gastrointestinal tract and the influence of energy intake[J].DomestAnimEndocrinol, 2010, 39(3): 181-193.

[9]TAYLOR-EDWARDS C C, BURRIN D G, HOLST J J, et al. Glucagon-like peptide-2 (GLP-2) increases small intestinal blood flow and mucosal growth in ruminating calves[J].JDairySci, 2011, 94(2): 888-898.

[10]CONNOR E E, KAHL S, ELSASSER T H, et al. Glucagon-like peptide 2 therapy reduces negative effects of diarrhea on calf gut[J].JDairySci, 2013, 96(3): 1793-1802.

[11]MORAN A W, AL-RAMMAHI M, ZHANG C, et al. Sweet taste receptor expression in ruminant intestine and its activation by artificial sweeteners to regulate glucose absorption[J].JDairySci, 2014, 97(8): 4955-4972.

[12]DRUCKER D J, YUSTA B. Physiology and pharmacology of the enteroendocrine hormone glucagon-like peptide-2[J].AnnuRevPhysiol, 2014, 76(76):561-583.

[13]NRC. Nutrient requirements of small ruminants: sheep, goats, cervids and new world camelids[M]. Washington, D. C: National Academy press, 2007.

[14]秦為琳. 應(yīng)用氣相色譜測定瘤胃揮發(fā)性脂肪酸方法的研究改進(jìn)[J]. 南京農(nóng)學(xué)院學(xué)報, 1982, 5(4): 110-116.

QIN W L. Determination of rumen volatile fatty acids by means of gas chromatography[J].JournalofNanjingAgriculturalCollege, 1982, 5(4): 110-116.(in Chinese)

[15]WANG A, GU Z, HEID B, et al. Identification and characterization of the bovine G protein-coupled receptor GPR41 and GPR43 genes[J].JDairySci, 2009, 92(6): 2696-2705.

[16]TSAI C H, HILL M, ASA S L, et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice[J].AmJPhysiol, 1997, 273(1):E77-E84.

[17]LEI Q C, BI J C, WANG X Y, et al. GLP-2 prevents intestinal mucosal atrophy and improves tissue antioxidant capacity in a mouse model of total parenteral nutrition[J].Nutrients, 2016, 8(1):33.

[18]BURRIN D G, STOLL B, GUAN X F, et al. Glucagon-like peptide 2 dose-dependently activates intestinal cell survival and proliferation in neonatal piglets[J].Endocrinology, 2005, 146(1):22-32.

[19]GHATEI M A, GOODLAD R A, TAHERI S, et al. Proglucagon-derived peptides in intestinal epithelial proliferation[J].DigDisSci, 2001, 46(6):1255-1263.

[20]YANO S, TAKEHARA K, TAZAWA H, et al. Cell-cycle-dependent drug-resistant quiescent cancer cells induce tumor angiogenesis after chemotherapy as visualized by real-time FUCCI imaging[J].CellCycle, 2017, 16(5):406-414.

[21]NARASIMHA A M, KAULICH M, SHAPIRO G S, et al. Cyclin D activates the Rb tumor suppressor by mono-phosphorylation[J].Elife, 2014, 3(3): e02872.

[22]LEE H J, JEDRYCHOWSKI M P, VINAYAGAM A, et al. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation[J].CellRep, 2017, 20(3):721-736.

[23]KANAKKANTHARA A, JEGANATHAN K B, LIMZERWALA J F, et al. Cyclin A2 is an RNA binding protein that controlsMre11 mRNA translation[J].Science, 2016, 353(6307): 1549-1552.

[24]LINDQVIST A, VAN ZON W, KARLSSON R C, et al. Cyclin B1-Cdk1 activation continues after centrosome separation to control mitotic progression[J].PLoSBiol, 2007, 5(5): e123.

[25]BARR A R, HELDT F S, ZHANG T L, et al. A dynamical framework for the all-or-none G1/S transition[J].CellSyst, 2016, 2(1): 27-37.

[26]?RSKOV C, HARTMANN B, POULSEN S S, et al. GLP-2 stimulates colonic growth via KGF, released by subepithelial myofibroblasts with GLP-2 receptors[J].RegulPept, 2005, 124(1-3):105-112.

[27]DUBE P E, FORSE C L, BAHRAMI J, et al. The essential role of insulin-like growth factor-1 in the intestinal tropic effects of glucagon-like peptide-2 in mice[J].Gastroenterology, 2006, 131(2): 589-605.

[28]LEEN J L, IZZO A, UPADHYAY C, et al. Mechanism of action of glucagon-like peptide-2 to increase IGF-I mRNA in intestinal subepithelial fibroblasts[J].Endocrinology, 2011, 152(2):436-446.

[29]JASLEEN J, ASHLEY S W, SHIMODA N, et al. Glucagon-like peptide 2 stimulates intestinal epithelial proliferationinvitro[J].DigDisSci, 2002, 47(5): 1135-1140.

[30]CONNOR E E, BALDWIN R L Ⅵ, CAPUCO A V, et al. Characterization of glucagon-like peptide 2 pathway member expression in bovine gastrointestinal tract[J].JDairySci, 2010, 93(11): 5167-5178.

[31]NEW D C, WONG Y H. Molecular mechanisms mediating the G protein-coupled receptor regulation of cell cycle progression[J].JMolSignal, 2007, 2:2.

[32]盧勁曄. 日糧能量水平對山羊瘤胃上皮生長的影響及機(jī)理研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

LU J Y. Effects of dietary energy intake on growth of rumen epithelium and its underlying mechanism in goats [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2012.(in Chinese)