蔡雯祎，熊顯榮，陳　通，楊顯英，韓　杰，阿果約達，李　鍵

(西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041)

組蛋白修飾主要包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化和類泛素化修飾[1]，這些修飾作用影響了染色質構象并調控目的基因表達，還參與了調控發(fā)育和內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等細胞學進程[2-3]。甲基化修飾是組蛋白共價修飾中最穩(wěn)定的，2004年第1個組蛋白的去甲基化酶LSD1 (Lysine specific demethylase 1)被發(fā)現(xiàn)前，組蛋白的甲基化一直被認為是不可逆的[4]。之后組蛋白去甲基化酶陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)其酶活性功能基團的差異可以分為兩大類：含Amino oxidase結構域的賴氨酸特異性去甲基化酶(Lysine specific demethylase，LSD)家族與含Jumonji特征結構域(Jumonji C domain，JmjC)的組蛋白去甲基化酶(Jumonji C domain containing histone demethylase, JHDM)家族。

JHDM1B也稱FBXL10，現(xiàn)在統(tǒng)一稱為KDM2B (Lysine-specific histone demethylase 2B)，屬于包含JmjC結構域的去甲基化酶亞家族。Y.I.Tsukada等[5]通過甲基化酶生化分析和質譜分析發(fā)現(xiàn)是H3K36的去甲基化酶，后來又發(fā)現(xiàn)其不僅僅是H3K36me1/2的去甲基化酶也是H3K4me3的去甲基化酶[6-7]，而且在發(fā)育和疾病的發(fā)生中具有重要作用。KDM2B在人的胰腺癌中高表達，它通過分離轉錄抑制和激活程序控制腫瘤的發(fā)生[8]。KDM2B受Oct4與Sox2的直接調控，在小鼠胚胎干細胞中招募多梳抑制復合體的核心組件，并通過CXXC結構域介導與CPG島的形成抑制分化相關基因的表達[9]。KDM2B在小鼠胚胎成纖維細胞中通過抑制p19ARF、p15lnk4b和p16Ink4a3個基因位點來調節(jié)細胞生長和衰老[10]。KDM2B能夠與重編程關鍵基因的啟動子區(qū)結合并激活轉錄，在誘導多功能干細胞的重編程早期發(fā)揮功能，提高誘導效率[11]。在斑馬魚上的研究發(fā)現(xiàn)，通過調節(jié)胚胎中KDM2B 的水平可以減緩幼體出生后眼睛殘缺(Ocular coloboma)、心缺陷(Heart defects)、鼻孔閉鎖(Atresia of the choanae)、生長和發(fā)育遲緩(Reta-rdation of growth and development)、生殖器畸形(Genital anomalies)和耳朵畸形或耳聾(Ear malformations/deaf-ness)的CHARGE綜合癥狀[12]。T.Fukuda等[13]發(fā)現(xiàn)，在KDM2B敲除的小鼠中細胞的增殖和凋亡異常，會導致早期胚胎在神經(jīng)、腦、視網(wǎng)膜和尾巴等方面的發(fā)育缺陷。L.Lu等[14]在非洲爪蛙上也發(fā)現(xiàn)，敲除KDM2B后胚胎出現(xiàn)頭部結構的萎縮和后部結構的喪失，而且KDM2B通過調節(jié)Wnt信號通路中β-Catenin的穩(wěn)定性來調控非洲爪蛙胚胎形成過程中前后體軸的形成。綜上，KDM2B對細胞增殖、凋亡、分化、衰老、腫瘤的形成以及胚胎的發(fā)育等都起到調控作用[15]。

牦牛是青藏高原地區(qū)的主要畜種，有“高原之舟”的美譽，但其繁殖力較低，大部分為兩年一胎或三年兩胎。目前還未見關于KDM2B基因在牦牛上的相關報道。本試驗以牦牛卵丘卵母細胞復合體為研究對象，通過RT-PCR克隆得到KDM2B基因的序列，進行生物信息學分析。并用qRT-PCR檢測KDM2B分別在不同時期卵母細胞及其對應卵丘細胞中的表達水平，旨在為進一步研究牦牛KDM2B基因功能及其在生理生殖過程中所發(fā)揮的作用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗樣品的采集

所有樣本均采自成都市青白江屠宰場，牦牛被屠宰后，迅速用無菌剪刀采集腦、小腸、腎、肺、脾、肝、心、胃、睪丸、肌肉、子宮和卵巢12種組織。無菌生理鹽水清洗，剪成小塊裝入凍存管，并在液氮中保存?zhèn)溆?。另外選擇3～5歲、體質良好、體型相似的且處于非黃體期的健康雌性牦牛采集卵巢，沖洗后，放入含有雙抗的25 ℃生理鹽水中，在保溫壺中保存，并于2 h內，送回實驗室。

1.2　卵丘-卵母細胞復合體(Cumulus-oocyte complex，COCs)的收集與培養(yǎng)

加有雙抗的生理鹽水預熱后，沖洗牦牛卵巢3遍，選擇卵巢上直徑為3～8 mm的卵泡，用10 mL的一次性注射器(帶12號針頭)抽取卵泡液，置于90 mm的平皿中，輕輕搖勻，在體視顯微鏡下，收集COCs。挑選卵丘顆粒細胞3層以上、卵母細胞質均勻且結構致密，用卵母細胞成熟液清洗3次后，置于含3 mL成熟液的培養(yǎng)皿中，每個平皿放30個COCs，在含5.5%的CO2,38.5 ℃濕度飽和的培養(yǎng)箱中體外成熟培養(yǎng)。從卵巢取出來的卵丘細胞包裹緊密的COCs處于GV期，成熟12 h后，卵丘細胞松散處于MI期，成熟24 h后，能觀察到第一極體的排除，處于MII期。因此，分別在0、12和24 h獲得GV、MI和MII期3個時期的COCs，用0.5%透明質酸酶將卵母細胞和卵丘顆粒細胞分離，進行后續(xù)研究。

1.3　試劑與培養(yǎng)液的配置

Trizol購自Invitrogen公司，DEPC購自天根生化科技有限公司，Single Cell-to-CTTM試劑盒購自Invitrogen公司，PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉錄試劑盒、Premix TapTMDNA聚合酶、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、pMD-19T載體、DNA Marker均購自TaKaRa公司，DNA膠回收試劑盒購自OMEGA公司，胎牛血清(FBS)、Medium1培養(yǎng)基購自Gibco公司，促黃體素(LH)、促卵泡素(FSH)、雌二醇、丙酮酸鈉、谷氨酰胺購自Sigma公司，石蠟油購自Vitrolife公司，地衣紅購自上海源葉生物，其他無特殊說明的試劑均為國產(chǎn)分析純。卵母細胞成熟液：M199+10% FBS+0.01 μg·L-1FSH+0.01 μg·L-1LH+0.001 μg·L-1E2+0.02 ng·L-1EGF。

1.4　總RNA的提取和反轉錄

根據(jù)Trizol法提取各個組織的總RNA，紫外分光光度計檢測濃度和OD值。質量符合要求的RNA樣品，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，用GAPDH基因的特異性引物檢測cDNA的質量，電泳出現(xiàn)亮條帶的cDNA放在-20 ℃保存?zhèn)溆谩⒎蛛x得到的不同時期的卵丘顆粒細胞和卵母細胞,按照Single Cell-to-CTTM試劑盒說明書直接合成cDNA，-20 ℃保存。

1.5　引物的設計與合成

根據(jù)GenBank中普通牛KDM2B基因的mRNA序列(登錄號：XM_019977355.1)和GAPDH基因mRNA序列(登錄號：AC_000162.1)，利用Primer5.0軟件分別設計PCR擴增引物(表1)。同時用NCBI中Primer-BLAST在線比對工具檢測引物的質量，引物由生工生物工程股份有限公司合成。

表1引物序列及其反應條件

Table1Primersequencesandreactionconditions

引物名稱Primersymbol引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm產(chǎn)物長度/bpProductsizeKDM2B-CF:CCCACAACTGCTGAAAATR:GAGCAATGGTCCAGAAAGCA58.54259KDM2B-QF:CAGACGGAAGCCACGAATR:CAGCACCCACTCCTCATACA60207GAPDH-QF:TGCTGGTGCTGAGTAGTTGGTGR:TCTTCTGGGTGGCAGTGATGG60290

KDM2B-C.克隆引物；KDM2B-Q和GAPDH-Q.定量引物。F.正向引物；R.反向引物

KDM2B-C. The cloning primer; KDM2B-Q and GAPDH-Q.The quantitative primers. F.Sense primer; R.Antisense primer

1.6　KDM2B基因的克隆測序

PCR擴增反應體系為25 μL：2×LA Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板1 μL，補ddH2O 9.5 μL。反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性20 s，58.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸4 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min，最后4 ℃保存。15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，紫外光下切目的條帶按照膠回收試劑盒說明書回收目的DNA。膠回收產(chǎn)物與PMD-19T載體16 ℃連接10 h，轉化到感受態(tài)細胞DH5α中。將菌液均勻接種在含有100 μg·mL-1氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，隨機挑取單菌落在搖床震蕩培養(yǎng)8 h，PCR篩選陽性克隆送交生工(上海)生物工程股份有限公司測序。

1.7　KDM2B蛋白生物信息學分析

NCBI中ORF Finder分析KDM2B序列的開放閱讀框，BLAST在線工具進行同源性比較， Protparam和ProtScale預測牦牛KDM2B蛋白的基本理化性質和親疏水性，PredictProtein和SWISS-MODEL預測KDM2B的二級結構和三級結構。

1.8　KDM2B基因組織表達譜分析

以GAPDH為參照，用實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測KDM2B基因在牦牛腦、小腸、腎、肺、脾、肝、心、胃、睪丸、肌肉、子宮和卵巢中的表達。qRT-PCR反應體系：SYBR-Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，補ddH2O至15 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣品重復3次。

1.9　KDM2B基因在牦牛卵母細胞減數(shù)分裂過程中的表達規(guī)律

qRT-PCR檢測KDM2B基因在牦牛卵母細胞減數(shù)分裂的3個不同階段(GV、MI、MII期)及其相應卵丘顆粒細胞中的表達規(guī)律。qRT-PCR反應體系同1.8，每個樣品重復3次。

1.10　數(shù)據(jù)分析

2-△△Ct法對實時熒光定量結果進行均一化處理，SPASS軟件進行方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，Duncan法對各組織間的mRNA表達量進行多重比較。

2　結　果

2.1　牦牛KDM2B基因的克隆及序列分析

以牦牛卵巢組織的總RNA為模板，利用RT-PCR對KDM2B基因的CDS區(qū)進行擴增，測序獲得4 259 bp的核苷酸序列(圖略)，開放閱讀框為3 930 bp，共編碼1 309個氨基酸。

目前GenBank中已經(jīng)測定的KDM2B基因序列僅有3種：人、小鼠和褐家鼠，其他動物的KDM2B基因均為預測序列。將克隆得到的牦牛KDM2B基因與黃牛(Bostaurus)、野牦牛(Bosmutus)、豬(Susscrofa)、綿羊(Ovisaries)、山羊(Caprahircus)、人(Homosapiens)、黑猩猩(Panpaniscus)、小鼠(Musmusculus)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、駱駝(Camelusdromedarius)、貓(Feliscatus)、原雞(Gallusgallus)和斑馬魚(Daniorerio)的KDM2B基因進行相似性比對，結果見表2。與其他哺乳動物相比，克隆得到的KDM2B基因的核苷酸序列的相似性達到90%以上，其中與人、小鼠和褐家鼠的相似性分別為92%、89%和90%；氨基酸序列相似性大都95%以上，其中與人、小鼠和褐家鼠的相似性都為96%。由此可見，KDM2B基因在進化過程中相對保守，而且堿基突變多為同義突變。

表2牦牛KDM2B基因與其他物種的相似性比對

Table 2　Alignment of yak KDM2B gene with the corresponding sequences of various species %

2.2　牦牛KDM2B蛋白結構和功能預測

ExPASy在線工具分析牦牛KDM2B蛋白的理化性質，該蛋白分子量為149 737.23，分子式為C6556H10474N1894O1971S74。脂肪族系數(shù)為71.40，半衰期為30 h，等電點為8.63，不穩(wěn)定系數(shù)為64.01，推測該蛋白為堿性不穩(wěn)定蛋白。KDM2B蛋白包含20種氨基酸，出現(xiàn)頻率較高的有Leu(9.3%)、Glu(9.2%)、Lys(8.0%)、Ser(7.9%)和Arg(7.7%)。其中帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)有206個，帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)有187個，所以KDM2B蛋白整體上帶正電。

Signal P和TM pred分析發(fā)現(xiàn)，牦牛KDM2B蛋白為不含跨膜結構和信號肽的非分泌蛋白。親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，牦牛KDM2B蛋白存在293、294、295、296位點存在最小親水指數(shù)-3.544，在539位點達到最大疏水指數(shù)2.222，平均親水指數(shù)為-0.728。牦牛KDM2B蛋白修飾預測發(fā)現(xiàn)，磷酸化位點有126個，包含79個Ser，39個Thr和8個Tyr；N-糖基化位點有3個；O-糖基化位點有84個，且閾值均在0.5以上。

牦牛KDM2B基因包括幾個主要的功能結構域：JmjC功能域，CXXC型鋅指結構域和PHD型的鋅指結構域，F(xiàn)-Box功能域和8個LRR(Leucine-rich repeat)重復序列(圖1)。KDM2B 蛋白的二級結構預測結果顯示，該蛋白的α-螺旋占35.14%，β-轉角占6.95%，延伸鏈占14.36%，無規(guī)卷曲占43.54%，同時，KDM2B蛋白的三級結構進一步驗證了二級結構的預測(圖2)。

圖1　KDM2B蛋白的結構域預測Fig.1　The predicted domain of yak KDM2B protein

圖2　KDM2B蛋白三級結構預測Fig.2　The predicted tertiary structure of yak KDM2B protein

2.3　牦牛KDM2B基因的組織表達譜

KDM2B基因在牦牛腦、小腸、腎、肺、脾、肝、心、胃、睪丸、肌肉、子宮和卵巢組織中的表達譜如圖3所示，結果表明，牦牛KDM2B基因在各個組織中均有表達，但表達量存在一定的差異，在脾、子宮、睪丸和卵巢中表達量較高，且與其他組織比差異極顯著(P<0.01)，而在胃、腦、肌肉中表達量較低。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同大寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01),the same capital letter mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖3　KDM2B基因組織表達水平Fig.3　Tissues expression levels of yak KDM2B gene

2.4　KDM2B在牦牛卵母細胞不同成熟階段的表達

以GAPDH基因為內參，用qRT-PCR方法分別檢測KDM2B基因在牦牛卵母細胞減數(shù)分裂的不同時期及其相應卵丘顆粒細胞中的表達情況(圖4)。在卵母細胞中GV期和MII期KDM2B的表達水平相差不大(P>0.05)，而MI期的表達水平極顯著高于這兩個時期(P<0.01)。在卵丘顆粒細胞中KDM2B的表達水平隨成熟時間的進行而極顯著增加(P<0.01)。

圖4　KDM2B基因在牦牛卵母細胞(A)和卵丘顆粒細胞(B)減數(shù)分裂不同階段的表達Fig.4　The expression of KDM2B in different stages during meiosis of the oocyte (A)and the cumulus cells(B) in yak

3　討　論

組蛋白修飾介導的表觀遺傳調控對哺乳動物的胚胎發(fā)育有至關重要的作用，其中組蛋白的甲基化修飾方式是最穩(wěn)定的。組蛋白的甲基化可以發(fā)生在精氨酸和賴氨酸的側鏈，每個殘基上的氨基氮都可以發(fā)生一次或多次的甲基化。組蛋白H3上特異性賴氨酸殘基的甲基化位點參與了多數(shù)基因的調節(jié)，包括一些與發(fā)育和分化相關的基因，如H3K4和H3K36上的甲基化與轉錄激活相關，H3K9和H3K27上的甲基化與基因沉默相關[16-17]。組蛋白去甲基化酶的發(fā)現(xiàn)推翻了組蛋白甲基化是單向發(fā)展的理論，這為人們解開了很多細胞內無法解釋的難題。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)組蛋白去甲基化酶家族成員有27個，其中KDM2B對細胞增殖、凋亡、分化、衰老、腫瘤的形成以及胚胎的發(fā)育等都起到調控作用。本研究在克隆牦牛KDM2B基因序列的基礎上，檢測其在不同組織中的表達，并研究其在卵母細胞減數(shù)分裂過程中的表達規(guī)律，為KDM2B的功能研究提供了試驗依據(jù)，同時也為提高牦牛的胚胎質量奠定基礎。

目前GenBank中已經(jīng)測定的KDM2B基因序列僅有3個：人、小鼠和褐家鼠，其他動物的KDM2B基因均為預測序列，而且不管是已確定的序列還是預測序列都有多個轉錄本。在人上有兩個轉錄本，分為長型和短型，長型與短型相比在5′端多出90 bp，在2 450 bp后多出114 bp。在黃牛上有8個預測轉錄本，在牦牛上有1個預測轉錄本，而本研究中只獲得了1條牦牛轉錄本?，F(xiàn)在還不清楚牦牛上是否有其他轉錄本的存在，而轉錄本的差異也導致了牦?；蚺c其他物種基因相似性和蛋白結構上的差異[18]。筆者克隆得到的牦牛KDM2B序列要比GenBank中預測的牦牛序列長一些，可能是長型與短型的區(qū)別，由此導致了蛋白上的差異，因此，還需后續(xù)研究進一步驗證牦牛上KDM2B基因是否還存在其他轉錄本。但從結構域的分析結果發(fā)現(xiàn)5個主要功能結構域：JmjC功能域(和組蛋白去甲基化酶活性有關)：CXXC型的鋅指結構域(結合DNA)，PHD型的鋅指結構域(結合DNA)，F(xiàn)-Box功能域(結合蛋白質)和LRR重復序列都存在，說明這些主要功能域在不同的物種間是高度保守的[13,19]。而且同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因與黃牛和野牦牛的同源性最高，表明，牦牛KDM2B基因在進化過程中具有較高的保守性。

組織表達譜的結果發(fā)現(xiàn)，牦牛KDM2B基因在脾和睪丸中的表達量較高，與R.Pfau等[20]的研究結果一致，還發(fā)現(xiàn)在子宮和卵巢中表達量也較高，而在胃、腦、肌肉中表達量最低。表觀遺傳學的變化被認為是癌癥細胞的顯著特征之一[21-22]，KDM2B由于其有效的抑癌作用被用作不同疾病的新的治療靶點，包括造血細胞腫瘤[23]和胃癌[24]等。脾是全身最大的免疫器官，KDM2B在脾中高表達說明其抑癌作用可能與機體的免疫系統(tǒng)有關系，該問題有待進一步的研究。在KDM2B缺失的細胞中KDM5A的表達量會顯著下降，并發(fā)現(xiàn)了一條KDM2B-KDM5A/Myc的調控通路[7]，而KDM5A與生殖息息相關[25]，通常只在生殖器官中表達。

KDM2B在胚胎發(fā)育過程中起至關重要的作用，一旦缺失會導致早期胚胎在神經(jīng)、腦、視網(wǎng)膜和尾巴等方面的發(fā)育缺陷[13]。在雌性胚胎中KDM2B的缺失會導致X染色體相關基因表達的減少以及常染色體基因的異常表達[26]。胚胎是由卵母細胞受精而成，而敲除KDM2B的雄性小鼠附睪的精子數(shù)量顯著降低[13]，之后M.Ozawa等[27]發(fā)現(xiàn)，KDM2B在長期可持續(xù)的精子發(fā)生中通過調節(jié)細胞周期起重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，KDM2B在卵母細胞減數(shù)分裂的不同時期都有表達，且主要在細胞核中表達。本試驗研究發(fā)現(xiàn)KDM2B在MI期顯著高于GV期和MII期的表達水平，這可能與卵母細胞減數(shù)分裂過程中的兩次分裂阻滯有關。在體內環(huán)境下，減數(shù)分裂從雙線期停滯恢復是由促性腺激素LH啟動的[28]。在LH的刺激下，壁顆粒細胞中cAMP水平上升，PKA和PKC通路被激活，合成大量的EGF樣因子，這些EGF樣因子激活卵丘細胞中MAPK的活性，促進減數(shù)分裂恢復后的細胞進程[29]。卵丘細胞中活化的MAPK通過磷酸化CX43導致間隙連接關閉，打斷卵丘細胞和卵母細胞之間的聯(lián)系[30]，使體細胞中的抑制因子無法進入卵母細胞，從而導致卵母細胞內cAMP水平的下降，進入第二次減數(shù)分裂中期停滯。KDM2B與cAMP在卵母細胞中的表達模式相一致，由此推測KDM2B可能參與了卵母細胞的減數(shù)分裂過程，這需要進一步的研究來驗證。

4　結　論

本試驗成功克隆了牦牛KDM2B基因序列，與牦牛已有預測序列相比，屬于長型轉錄本；生物信息學分析發(fā)現(xiàn)CDS區(qū)的保守性較強；在脾、子宮、睪丸和卵巢中的表達量較高，而在胃、腦、肌肉中的表達量較低。為KDM2B基因在牦牛繁殖調控中的進一步研究提供理論依據(jù)。在卵母細胞中GV期和MII期KDM2B的表達水平相差不大(P>0.05)，而MI期的表達水平極顯著高于GV期和MII期(P<0.01)。在卵丘細胞中KDM2B的表達水平隨成熟時間的進行而極顯著增加(P<0.01)。這可能與減數(shù)分裂過程中的兩次分裂阻滯有關，為進一步研究牦牛卵母細胞減數(shù)分裂機制及改善牦牛繁殖效率提供基礎資料。

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