牛　姝，程笳琪，高淑媛，曹校瑞，吳晉強，陸　娜，閆瑞琴，赫曉燕

(山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801)

毛囊(Hair follicle,HF)是一個高度敏感的小器官，具有重建自身的能力。在出生后的生活中，其周期變換從快速生長期(生長期)開始，通過凋亡驅(qū)動回歸期(退行期)到達相對靜止(靜止期)[1-2]。這種周期性變化受多種因素的影響。其中，成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor,FGF)家族由7個亞家族組成，相關(guān)研究表明，F(xiàn)GF7亞家族(包括FGF7、FGF10和FGF22)對皮膚發(fā)育和修復起重要作用[3-5]。D.Schmid等[6]研究表明，F(xiàn)GF7和頭蛋白(Noggin)對于誘導新的毛發(fā)生長周期起到重要作用。FGF10多存在于小鼠的肺、心和皮膚真皮部分，具有促進毛發(fā)生長的生物活性，對于治療脫發(fā)有重要作用[7]。在成年小鼠皮膚中，F(xiàn)GF22在毛囊的內(nèi)根鞘中表達[8]。FGF22也可用作受損傷口愈合和其他上皮中可能出現(xiàn)的損傷的治療工具，對皮膚發(fā)育和修復起重要作用[9]。而在小鼠第一個毛囊生長周期中，F(xiàn)GF7亞家族對其作用的研究未見報道。根據(jù)前人對于小鼠毛囊周期結(jié)構(gòu)的研究，結(jié)合本試驗小鼠出生后毛囊的生長情況，確定毛囊第一個生長周期的劃分大致為第1～11天為生長期，第12～17天為退化期，第18～19天為靜止期，第20天毛囊開始進入下一個生長周期。本研究利用實時熒光定量PCR技術(shù)、免疫組織化學技術(shù)和Western blot技術(shù)，對FGF7/FGF10/FGF22在小鼠第一生長周期不同階段皮膚組織中的表達進行研究，觀察FGF7/FGF10/FGF22在小鼠第一個毛囊生長周期不同階段的差異表達，以了解FGF7/FGF10/FGF22對小鼠第一個毛囊生長周期的作用，為揭示FGF7亞家族對小鼠毛發(fā)生長調(diào)節(jié)機制奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗動物

出生后第1、3、5、8、16、18、20、23 天的白色ICR(Institute of Cancer Researcch)小鼠，每天各取3只，每只背部取約2 cm2的皮膚組織塊2份。1份液氮保存；1份浸蠟固定包埋。

1.2　主要儀器與試劑

FGF7兔抗多克隆抗體(Thermo公司)；FGF10兔抗多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc)；FGF22兔抗多克隆抗體(Novus Biologicals公司)；兔Streptavidin-HRP DAB試劑盒和高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒(康為世紀公司)；凝膠配制試劑盒和RIPA裂解液(強)(碧云天公司)；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ和PrimeSciptTMRT-PCR Kit(TaKaRa公司)。

1.3　方法

1.3.1免疫組織化學按照兔Streptavidin-HRP試劑盒(DAB)說明書進行試驗。將組織切片于高濃度至低濃度的梯度酒精中復水，滴加試劑Ⅰ(H2O2內(nèi)源性過氧化物酶封閉液)于37 ℃烘箱內(nèi)10 min，PBS沖洗。滴加試劑Ⅱ(正常山羊血清)封閉，37 ℃靜置10 min。棄掉血清，切片上一組滴加1∶60稀釋的兔抗FGF7多克隆抗體(1∶45稀釋的兔抗FGF10多克隆抗體；1∶50稀釋的兔抗FGF22多克隆抗體)，對照組滴加等量的血清封閉液，37 ℃烘箱30 min后，置于冰箱4 ℃過夜，第2天室溫復溫30 min，PBS沖洗，滴加試劑Ⅲ(生物素標記羊抗兔二抗工作液)，37 ℃放置10 min。PBS沖洗，滴加試劑Ⅳ(HRP標記的鏈霉親和素)，PBS沖洗；滴加DAB顯色液，觀察顯色效果適當調(diào)整時間(最多不超過5 min)，蒸餾水沖洗，蘇木精復染1 min，蒸餾水沖洗，再經(jīng)低濃度至高濃度酒精脫水二甲苯透明，中性樹膠封片。利用Leica光學顯微鏡觀察切片，并采集圖片。每一個樣本選擇3張片子，每個片子上選取至少3個以上視野進行拍照。并且應用圖像分析軟件Image-Proplus 6.0對出生前后小鼠切片中FGF7、FGF10和FGF22的陽性反應物進行光密度測定，并進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.2Western blot檢測根據(jù)RIPA裂解液(強)說明書提取總蛋白，每孔蛋白上樣量為400 ng，在12% SDS-PAGE進行電泳分離，電泳完120 V 1 h轉(zhuǎn)至NC膜，5%的脫脂蛋白干粉封閉1 h，4 ℃過夜孵育一抗(1∶800稀釋的兔抗FGF7多克隆抗體；1∶500稀釋的兔抗FGF10多克隆抗體；1∶700稀釋的兔抗FGF22多克隆抗體)。次日室溫復溫30 min，TBST緩沖液沖洗10 min×3，孵育二抗(1∶12 000，HRP-山羊抗兔IgG，康為世紀公司；1∶12 000，HRP-山羊抗鼠IgG，康為世紀公司)，37 ℃搖床1 h，TBST緩沖液 5 min×4，最后，NC膜涂發(fā)光液利用凝膠成像系統(tǒng)進行曝光，并在暗室中壓膠片。使用Image J軟件對FGF7、FGF10、FGF22和內(nèi)參β-actin蛋白的結(jié)果圖進行灰度值測定。

1.3.3實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測根據(jù)NCBI中登錄的小鼠(Musmusculus)FGF7(序列號：NM_008008.4)、FGF10 (序列號：NM_008002.4)和FGF22(序列號：NM_023304.1)與β-actin(序列號：NM_007393.5)基因的序列，運用Primer5.0進行特異性引物設(shè)計，并送華大基因公司合成。引物序列見表1。

表1目的基因與內(nèi)參β-actin引物序列

Table1Primersequencesoftargetgenesandβ-actin

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物大小/bpProductssize退火溫度/℃AnnealtemperatureFGF7F:ATGCTTCCACCTCGTCTGTR:ATCTCCTGGGTCCCTTTCA22258FGF10F:TGGTGTCTTCGTTCCCTGTR:GCTGACCTTGCCGTTCTT21858FGF22F:TGGGTTGCGGGTCTACTCTR:TCGTGTCCGTCTGCCTTGC15762β-actinF:GCTGTCCCTGTATGCCTCTR:GATGTCACGCACGATTTCC22258～62

取液氮罐中的組織按照 Trizol試劑盒說明書提取不同天數(shù)小鼠皮膚組織的總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收目的片段DNA，送華大基因公司測序。按照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并調(diào)整濃度為100 ng·μL-1。每個樣本進行3次有效重復。反應體系：SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)5 μL，ROX Reference Dye(50×)0.2 μL，F(xiàn)GF7/FGF10/FGF22/β-actin正反向引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，dH2O(滅菌蒸餾水)3 μL。FGF7和FGF10反應條件：95 ℃預變性10 min;94 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)；FGF22反應條件：95 ℃預變性10 min;94 ℃變性5 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。擴增結(jié)束得到CT值，利用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達水平，各基因差異倍數(shù)以2-ΔΔCT表示。

1.4　數(shù)據(jù)分析

免疫組化光密度值結(jié)果用“平均值±標準差(mean±SE)”表示，免疫組化光密度值、Western blot和RT-PCR統(tǒng)計結(jié)果利用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，各基因蛋白表達差異顯著程度均以最低表達天數(shù)為對照。其中，*P<0.05表示差異顯著，**P<0.01表示差異極顯著。

2　結(jié)　果

2.1　FGF7、FGF10和FGF22蛋白在出生后小鼠皮膚組織中的定位

免疫組織化學結(jié)果顯示，在毛囊第一生長周期，F(xiàn)GF7主要表達于毛囊內(nèi)根鞘及表皮(圖1)。第1天主要表達于表皮；第3、5、8、16和18天主要表達于內(nèi)根鞘和表皮；第20 天表達較為廣泛，在內(nèi)外根鞘及毛囊間真皮成纖維細胞等均有表達；第23天主要在內(nèi)根鞘和表皮有陽性反應。FGF10在出生后毛囊的表達較為廣泛，在表皮、皮脂腺等均有陽性反應(圖2)。第1天主要表達于表皮，第3 天開始在毛囊各結(jié)構(gòu)廣泛表達，第18天皮脂腺處陽性反應較強。FGF22在毛囊第一生長周期中表達較為廣泛，毛基質(zhì)、內(nèi)根鞘及外根鞘等均有陽性反應，但在不同階段，其表達的強弱不同(圖3)。光密度數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)GF7、FGF10和FGF22蛋白在不同階段組織中的表達水平均存在顯著差異，其中FGF7在第5天表達量最高，第16天降至最低，伴隨靜止期的開始，F(xiàn)GF7在毛囊中的表達量逐漸升高。第1、3、5、8、18、20、23天的表達量極顯著高于第16 天(P<0.01)，其表達量分別是第16 天的1.250倍、1.470倍、1.636倍、1.142倍、1.102倍、1.335倍和1.616倍(表2，圖4A′)。FGF10與FGF7趨勢相似，在第3天表達量達到最高，第8天表達量降至最低，退化期～第二生長期的相對表達量逐漸增高。第1、3、5、16、18、20、23天的表達量極顯著高于第8天(P<0.01)，其表達量分別是第8天的1.302倍、1.975倍、1.244倍、1.218倍、1.300 倍、1.350倍和 1.680倍(表2，圖4B′)。FGF22在第16天表達量達到最高，之后隨著時間增加表達量逐漸降低。第1、3天的表達量顯著高于第23天(P<0.05)，第5、8、16、18、20天的表達量極顯著高于第23 天(P<0.01)。第1、3、5、8、16、18、20 天分別是第23天的1.093倍、1.147倍、1.235倍、1.336 倍、1.712倍、1.506倍和 1.358倍(表2，圖4C′)。

A～H.不同天數(shù)小鼠背部皮膚毛囊的陰性反應；a～h.不同天數(shù)小鼠背部毛囊的陽性反應。A和a.1 d；B和b.3 d；C和c.5 d；D和d.8 d；E和e.16 d；F和f.18 d；G和g.20 d；H和h.23 d。1.毛乳頭；2.毛基質(zhì)；3.內(nèi)根鞘；4.外根鞘；5.表皮；6.皮脂腺。下同A-H.Hair follicle negative reaction of different days in mice back skin; a-h.Hair follicle positive reaction of different days in mice back skin. A and a.1 d; B and b.3 d; C and c.5 d; D and d.8 d; E and e.16 d; F and f.18 d; G and g.20 d; H and h.23 d. 1.Dermal papilla; 2.Hair matrix; 3.Inner root sheath; 4.Outer root sheath; 5.Epidermis; 6.Sebaceous glands.The same as below圖1　FGF7蛋白在小鼠毛囊第一生長周期皮膚的定位(20×)Fig.1　Location of FGF7 protein in mice skin in the first hair follicle cycle(20×)

圖2　FGF10蛋白在小鼠毛囊第一生長周期皮膚的定位(20×)Fig.2　Location of FGF10 protein in mice skin in the first hair follicle cycle(20×)

表2陽性表達的平均光密度

Table2Averageopticaidensityofpositivecellsinpostnatalmiceskin

項目Item1d3d5d8d16d18d20d23dFGF70.2039±0.005**0.2398±0.001**0.2669±0.003**0.1863±0.003**0.1631±0.00020.1798±0.0001**0.2179±0.010**0.2637±0.006**FGF100.2236±9.615E-06**0.3391±0.005**0.2136±0.001**0.1717±0.0010.2091±0.001**0.2229±0.009**0.2319±0.002**0.2885±0.002**FGF220.2504±0.002*0.2626±0.012*0.2829±0.004**0.3060±0.006**0.3939±0.007**0.3450±0.003**0.3111±0.005**0.2290±0.009

*.P<0.05;**.P<0.01。下同

*.P<0.05;**.P<0.01.The same as below

圖3　FGF22蛋白在小鼠毛囊第一生長周期皮膚的定位(20×)Fig.3　Location of FGF22 protein in mice skin in the first hair follicle cycle(20×)

A.生長期；C.退行期；T.靜止期。下同A.Anagen.C.Catagen,T.Telogen.The same as below圖4　FGF7(A′)、FGF10(B′)和FGF22(C′)蛋白在小鼠皮膚的平均光密度分析Fig.4　Average optical density analysis of FGF7(A′), FGF10(B′) and FGF22(C′) protein in mice skin

2.2　FGF7、FGF10和FGF22蛋白在小鼠皮膚組織中的表達

Western blot結(jié)果顯示，在小鼠毛囊第一生長周期中均存在與FGF7、FGF10、FGF22多克隆抗體發(fā)生陽性反應的條帶，F(xiàn)GF7大小為27 ku，F(xiàn)GF10大小為23 ku，F(xiàn)GF22大小為21 ku(圖5)。通過分析得出，F(xiàn)GF7蛋白在第16天表達量最低，伴隨靜止期的開始，表達量逐漸升高。第1、3、5、18、20、23天的表達量極顯著高于第16天(P<0.01)，第8 天的表達量顯著高于第16天(P<0.05)。第1、3、5、8、18、20、23 天分別是第16天的1.643倍、2.045倍、1.523倍、1.407倍、1.739倍、1.974倍、2.035倍(圖6A′)。FGF10蛋白在第8天表達量最低，第1、3、5、16、18、20、23天的表達量極顯著高于第8天(P<

0.01)，其表達量分別是第8 天的1.390倍、2.632倍、1.403倍、1.374倍、2.468倍、2.755倍、3.101倍(圖6B′)。FGF22在第16天的相對表達量達到最高，其后隨著毛囊萎縮進入靜止期表達量逐漸降低。第3、5、8、16、18、20、23天的表達量極顯著高于第1 天(P<0.01)，且表達量是第1天的1.601倍、1.870倍、2.198倍、2.474倍、2.378倍、1.878倍、1.533倍(圖6C′)。

圖5　FGF7、FGF10和FGF22蛋白在小鼠皮膚的蛋白印跡Fig.5　Western blot band of FGF7,FGF10 and FGF22 protein in mice skin

圖6　FGF7(A′)、FGF10(B′)和FGF22(C′)蛋白在小鼠皮膚的相對表達量Fig.6　Relatire expression of FGF7(A′),FGF10(B′) and FGF22(C′) proteins in mice skin

2.3　FGF7、FGF10和FGF22基因在小鼠皮膚組織中的表達

RT-PCR結(jié)果顯示，在小鼠毛囊第一生長周期中，F(xiàn)GF7在第16天的表達量最低，伴隨靜止期的開始，F(xiàn)GF7在毛囊中的表達量逐漸升高，第1、3、5、8、20、23 天極顯著高于第16天(P<0.01)，第18 天顯著高于第16天(P<0.05)。第1、3、5、8、18、20、23 天的表達量分別是第16天的1.819倍、3.703倍、3.551倍、1.347倍、1.165倍、2.287倍和2.502倍(圖7A′)。FGF10在第3天表達量達到最高，在第8天表達量降至最低，退化期開始表達量逐漸增高。第1、3、5、16、18、20和23天的表達量極顯著高于第8 天(P<0.01)，第16天顯著高于第8天(P<0.05)。第1、3、5、16、18、20和23天分別是第8 天的2.640倍、4.686倍、2.095倍、1.135倍、1.327倍、1.532倍和2.278倍(圖7B′)。FGF22在第16天的表達量達到最高，其后隨著毛囊萎縮進入靜止期表達量逐漸降低。第1、3、5、8、16、18和20天的表達量極顯著高于第23天(P<0.01)，且表達量分別是第23 天的2.037倍、14.530倍、21.523倍、31.649倍、40.176倍、31.741倍和26.153倍(圖7C′)。

圖7　FGF7(A′)、FGF10(B′)和FGF22(C′) mRNA在小鼠皮膚的相對表達量Fig.7　Relative expression of FGF7(A′),FGF10(B′) and FGF22(C′) mRNA in mice skin

3　討　論

毛囊是一種通過組織生長和重塑循環(huán)產(chǎn)生毛發(fā)的動態(tài)結(jié)構(gòu)。毛囊發(fā)育主要經(jīng)歷生長期(Anagen)、退行期(Catagen)和靜止期(Telogen)3個時期[1-2]。在生長期，毛乳頭從真皮生長到皮下組織，毛母質(zhì)細胞末梢產(chǎn)生角質(zhì)形成細胞分化層并形成毛囊內(nèi)根鞘和毛干，毛囊長度逐漸達到最大，且毛囊各結(jié)構(gòu)清晰可見易于識別。隨著毛基質(zhì)細胞的供給下降，毛囊進入退行期，毛囊及整體皮膚厚度均在縮減，當毛乳頭逐漸變?yōu)榫o湊的球形，毛囊進入靜止期，此時毛囊不顯示內(nèi)根鞘結(jié)構(gòu)并完全由毛囊間真皮成纖維細胞包圍。毛囊的周期變化發(fā)育受到各種生長因子的影響。

FGF7是由上皮組織中的間充質(zhì)細胞(例如成纖維細胞/纖維細胞)合成和分泌的，具有163個氨基酸編碼的糖蛋白，同時FGF7作為上皮細胞增殖的旁分泌介質(zhì)，并具有刺激上皮細胞的遷移、擴散和增殖的作用[10-12]。已有研究顯示，F(xiàn)GF7是負責指導毛胚細胞增殖并誘導新毛發(fā)生長周期的毛乳頭信號[6]。據(jù)程毅[13]研究可知，毛乳頭啟動新的毛囊周期。在真表皮相互作用中, 真皮成分起主導作用，但表皮成分可反作用于間質(zhì), 例如角質(zhì)形成細胞可產(chǎn)生一種特異因子刺激體內(nèi)的毛乳頭細胞生長[14]。M.V.Plikus[15]發(fā)現(xiàn)誘導新毛發(fā)周期開始需要多種信號通路共同調(diào)節(jié)。在靜止期前激活態(tài)的FGF7信號(由FGFR2 IIIb受體介導)表達量較低，在靜止期時，開始激活更多的FGF7信號。本研究免疫組化結(jié)果表明，F(xiàn)GF7小鼠第一生長周期中主要在毛囊內(nèi)根鞘及表皮表達?？赡苁且驗镕GF7對于角質(zhì)形成細胞增殖、存活、分化有重要作用。本研究的免疫組化光密度值、實時熒光定量PCR及Western blot結(jié)果均顯示FGF7在靜止期和第二生長期的相對表達量顯著高于生長期和退行期，結(jié)果與M.V.Plikus[15]一致。此研究結(jié)果提示，F(xiàn)GF7可能對小鼠毛囊生長早期發(fā)育與誘導毛囊進入新的循環(huán)周期有重要作用。

FGF10又可稱為角質(zhì)形成細胞生長因子-2(KGF-2)，以旁分泌方式介導間充質(zhì)與上皮信號傳導，在多個器官中發(fā)揮重要的作用[16-17]。K.Suzuki等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在缺乏FGF10的新生小鼠皮膚組織中基底層的增殖細胞數(shù)目在減少，顆粒層發(fā)育不全，缺乏獨特的透明角質(zhì)顆粒和張力原纖維，缺乏FGF10，表現(xiàn)為表皮形態(tài)異常。M.Igarashi等[19]研究表明，F(xiàn)GF10長期在人皮膚的真皮乳頭細胞、外根鞘細胞和表皮角質(zhì)形成細胞表達。J.H.Jang[20]研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中表達的rhKGF-2具有促進人毛發(fā)生長的生物活性，提示rhKGF-2對毛發(fā)生長有刺激作用。本研究免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)GF10在小鼠皮膚中表達較為廣泛，表皮、皮脂腺等均有陽性反應，與M.Igarashi等[19]結(jié)論一致。出生后1 d，只在表皮表達，可能是因為FGF10刺激上皮細胞增殖，從而為毛母質(zhì)細胞的增殖分化提供基礎(chǔ)。免疫組化光密度、實時熒光定量與Western blot結(jié)果均表現(xiàn)為毛囊生長期初中期與靜止期～第二生長期初期的相對表達量高于生長末期和退化期。在生長期末期FGF10的表達減弱，可能由于內(nèi)外根鞘的分化及真皮乳頭逐漸減少消失，導致表達量降低，與前人研究結(jié)果一致。此研究結(jié)果提示，F(xiàn)GF10可能對于誘導毛囊進入新的循環(huán)周期同樣起重要作用。

FGF22是與FGF7和FGF10密切相關(guān)的FGF7亞家族的另一成員，參與表皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)。除了FGF7和FGF10，F(xiàn)GF22也可用作治療受損傷口愈合的工具，且用于其他上皮中可能存在的損傷的治療。C.L.Li等[21]研究FGF22在發(fā)育過程中的表達譜，表明FGF22在毛囊形態(tài)發(fā)生中具有潛在的作用。免疫組化結(jié)果顯示，在小鼠皮膚中，F(xiàn)GF22在各天數(shù)毛囊中存在不同程度的廣泛表達，外根鞘、表皮及皮脂腺等均有表達。免疫組化光密度值、實時熒光定量PCR及Western blot檢測均顯示，F(xiàn)GF22在毛囊生長期后期及退化期前期的相對表達量最高，其后隨著毛囊萎縮進入靜止期逐漸降低。提示FGF22對于誘導毛囊進入退化可能有重要影響。

T.A.Beyer等[22]研究表明，F(xiàn)GF22蛋白質(zhì)與FGF7和FGF10相反，缺乏大多數(shù)分泌型FGF應有的特征，即N-糖基化的共有序列。同時Y.Katoh等[23]通過比對哺乳動物的FGF7啟動子、FGF10啟動子和FGF22啟動子，發(fā)現(xiàn)具有bHLH結(jié)合位點和CCAAT盒的FGF7啟動子與具有雙bHLH結(jié)合位點的FGF10啟動子較為保守，而FGF22啟動子則不同，表明FGF22與FGF7、FGF10之間有較大差異。結(jié)合本研究結(jié)果可知，F(xiàn)GF7、FGF10在小鼠出生后毛囊生長期表達量大，在毛囊退化期表達量逐漸減少，在靜止期～第二生長期表達量則逐漸增加，而FGF22則主要在毛囊生長期末期～退化期早期高表達，在靜止期表達逐漸降低。提示FGF7、FGF10在毛囊發(fā)育過程中可能對小鼠毛囊生長早期發(fā)育與誘導毛囊進入新的循環(huán)周期有重要作用，而FGF22則可能對誘導毛囊進入退化期有重要影響。

4　結(jié)　論

本研究結(jié)果表明，在小鼠第一生長周期過程中，F(xiàn)GF7主要表達于毛囊內(nèi)根鞘及表皮，F(xiàn)GF10和FGF22廣泛表達于毛囊各部。RT-PCR、Western blot和免疫組化光密度統(tǒng)計結(jié)果表明，F(xiàn)GF7在毛囊退化期表達量最低，在靜止期、生長期高表達；FGF10在毛囊生長期末期逐漸降低，退化期開始逐漸升高；FGF22在毛囊退化期表達量最高，在靜止期、生長期低表達。提示FGF7、FGF10在毛囊第一生長周期可能對誘導毛囊進入新的循環(huán)周期有重要作用，而FGF22則可能對誘導毛囊進入退化期有重要影響。

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