□段瑩星

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河南 新鄉(xiāng) 453007）

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)簡(jiǎn)介

基因編輯技術(shù)已經(jīng)發(fā)展更新了四代，分別是：ZFNS編輯技術(shù)、TALENS編輯技術(shù)、MGN編輯技術(shù)、CRISPR/Cas系統(tǒng)，本文著重介紹CRISPR/Cas9技術(shù)。21世紀(jì)初期，古細(xì)菌和真菌的對(duì)抗外來病毒的免疫方法被科學(xué)家在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，起主要作用的是細(xì)菌基因組的成簇規(guī)律重復(fù)間隔短回文序列(CRISPR)和能夠切割外源DNA片段的Cas蛋白。CRISPR/Cas9技術(shù)工作的原理是：CRISPR/Cas系統(tǒng)將病毒的基因整合到CRISPR的間隔序列中，記憶保存，當(dāng)同種基因序列入侵時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確特異切割。具體方法：外源基因組的三個(gè)保守核苷酸NGG（N可以為任何核苷酸）又稱為PAM(Protospacer adjacent motifs)基序，該基序可以被向?qū)NA(sgRNA)識(shí)別，sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白在PAM上游切割。斷鏈的DNA有兩種修復(fù)方式即非同源末端鏈接和同源末端鏈接，其中非同源末端連接的修復(fù)方式可以大大提升突變效率。由于CRISPR的向?qū)NA只需要20多個(gè)核苷酸序列就能識(shí)別到PAM基序，并且Cas9蛋白單聚體就能發(fā)揮作用，操作簡(jiǎn)單方便，定位精準(zhǔn)，所以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)被廣泛應(yīng)用在植物基因編輯中。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用

2.1 改良農(nóng)作物品質(zhì)

利用CRISPR/Cas9技術(shù)在植物體內(nèi)進(jìn)行基因編輯的技術(shù)路線一共分為五步：（1）確定靶標(biāo)基因組，選擇20bp的靶標(biāo)序列連接PAM；（2）設(shè)計(jì)與靶序列配對(duì)的sgRNA序列；（3）把sgRNA和Cas蛋白連接起來；（4）通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移法等方法轉(zhuǎn)入植物；（5）獲得轉(zhuǎn)基因植物。

多種模式植物、農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物已經(jīng)通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)做到了基因改造，實(shí)現(xiàn)了農(nóng)作物基因改良。例如：玉米的Zm IPK基因改造后植酸合成更合理；煙草Nt PDS基因改造后葉片黃化減輕；水稻Os SWEET1a等基因改造后，細(xì)菌性白葉枯病抗性增強(qiáng)；番茄Sl ANT1基因改造后，組織過表達(dá)花青素等。已公布研究表示，CRISPR/Cas9技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)調(diào)控植物代謝過程、抗病性增強(qiáng)等，為開發(fā)更容易成活、經(jīng)濟(jì)效益更高的農(nóng)作物提供了有力的工具[1]。

2.2 在基因工程育種中的研究應(yīng)用

實(shí)驗(yàn)證明，磺酰脲類和苯達(dá)松類除草劑對(duì)水稻沒有作用，原因是水稻的bel基因?qū)@兩類藥物有抗性。經(jīng)過CRISPR/Cas9技術(shù)的敲除，構(gòu)建特異性的sgRNA序列和Cas蛋白，突變株的性狀有所改善。其中，同源修復(fù)的純合突變株，表現(xiàn)為對(duì)磺酰脲類和苯達(dá)松類除草劑敏感。由于CRISPR/Cas9技術(shù)可以進(jìn)行多基因位點(diǎn)編輯，所以其在多倍體上也有應(yīng)用。例如玉米植酸，一旦不能被動(dòng)物消化，經(jīng)排泄就會(huì)對(duì)環(huán)境造成危害?？茖W(xué)家就針對(duì)玉米植酸合成的關(guān)鍵基因進(jìn)行了敲除，并且獲得了不同突變率的突變體，為提供更適宜人類農(nóng)業(yè)發(fā)展需要的植物物種提供了思路[2]。

2.3 植物基因功能研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)提供了鑒定基因功能的思路。要知道某物種基因組中特定基因的功能，可以利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)把此物種基因組的靶基因敲掉（如上文所介紹的基因敲除）。對(duì)比觀察編輯前后植株的性狀及生理特點(diǎn)，可以達(dá)到估計(jì)基因功能的目的。此外，上文提到的編輯水稻bel基因，轉(zhuǎn)化方式是影響CRISPR/Cas9編輯效率的重要因素，使用基因槍法轉(zhuǎn)化sgRNA序列和Cas蛋白會(huì)獲得更高的突變效率，有助于多個(gè)基因的定點(diǎn)插入。單基因定點(diǎn)編輯，使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法效率更高。

結(jié)束語

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是新型生物技術(shù)的代表，自其發(fā)現(xiàn)以來，應(yīng)用和研究在不斷地深化，在農(nóng)作物品種改良、基因工程育種、基因工程育種中的研究辦法、植物基因功能的研究等多個(gè)領(lǐng)域都有了重要突破。從科學(xué)的角度看，通過基因編輯技術(shù)得到的轉(zhuǎn)基因植物可能不會(huì)帶來更高的健康風(fēng)險(xiǎn)或環(huán)境危害，但是怎么利用基因編輯技術(shù)是我們都應(yīng)該思考的問題，也為監(jiān)管工作帶來了更大挑戰(zhàn)。

[1]郝麗芬,等.CRISPER/Cas9基因編輯技術(shù)及在農(nóng)作物品種改良研究中的應(yīng)用[J].北方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2017,45(3)：29-35.

[2]姚祝平,等.CRISPER/Cas9基因編輯技術(shù)在植物基因工程育種中的應(yīng)用[J].分子植物育種,2017,45,(7)：2647-2655.