吳余燕　徐佳佳　鄧超澄　劉華鋼　湯婷婷

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（南寧 530001）；2廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（南寧 530021）

肺癌是目前世界各國最常見的惡性腫瘤之一，也是男性病死率最高的惡性腫瘤，治療效果差，術(shù)后易復(fù)發(fā)［1-2］。因此，研究更多高效低毒的藥物用于治療或輔助治療肺癌是許多學(xué)者的研究方向。二乙酰二去水衛(wèi)矛醇（DADAG）是將去水衛(wèi)矛醇（DAG）結(jié)構(gòu)的3，4位羥基酯化得到［3］。本課題組前期研究［4-7］證實DAG對肺癌、腦腫瘤、卵巢癌等腫瘤細胞有明顯的抑制作用。其他學(xué)者［8-11］發(fā)現(xiàn)DADAG對肝癌細胞HLE、BEL?7404、SMMC?7721、白血病L1210細胞的生長有明顯的抑制作用。本研究通過探討DADAG對肺癌細胞株NCI?H460增殖和凋亡的影響，從而為尋找出更多治療肺癌的化療藥物提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試劑與藥物RPMI1640培養(yǎng)基（賽默飛世爾儀器有限公司）；胎牛血清（維森特生物技術(shù)有限公司）；PBS（0.01 mol/L）、青鏈霉素混合液（100 U/mL）、MTT、Giemsa染色液（北京索萊寶科技有限公司）；AO/EB染色液、細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；RNAiso Plus試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMII、PrimeScriptTMRTreagent Kit（日本TaKara公司）；DADAG由廣西醫(yī)科大學(xué)有機與藥物化學(xué)教研室提供，用RPMI1640培養(yǎng)基溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾后-20℃保存，臨用前用培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.2細胞肺癌細胞株NCI?H460購買于中國科學(xué)院細胞庫。

1.3儀器311型CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher scien?tific，USA）；SpectraMaxPlus384型酶標(biāo)儀（Tecan Austria GmbH）；CFM?500E型倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠出品）；FacsCalibur型流式細胞儀（美國Becton Dickson公司）；7300型Real?time PCR System（美國ABI公司）。

1.4實驗方法

1.4.1細胞培養(yǎng)細胞于25 cm2培養(yǎng)瓶中以配好的完全培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清和青鏈霉素混合液）培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，實驗均采用對數(shù)期增殖細胞。

1.4.2細胞增殖抑制率的測定（MTT法）取NCI?H460細胞調(diào)整密度為5 000/孔接種于96孔板中，細胞貼壁24 h后，加入含不同濃度DADAG的完全培養(yǎng)液100 μL，同時設(shè)置不含藥的空白對照組，設(shè)置4個復(fù)孔。放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩溶解，于490 nm波長酶標(biāo)儀測定吸光度值（OD）。實驗重復(fù)3次。抑制率=（1?實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.4.3集落形成實驗檢測細胞集落形成能力接種細胞500/孔于6孔板中，每孔1 mL。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)144 h，倒置顯微鏡下觀察細胞增殖情況。待單個細胞分裂至30～50個細胞后，算一個集落的形成。棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，分別加含DADAG 11.50、23.00、46.00、69.00 μg/mL的完全培養(yǎng)基，1.5 mL，設(shè)置1個空白對照孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)液體，PBS清洗2遍，每孔加入1 mL甲醇固定10 min，棄去甲醇空氣中干燥。用Giemsa染色液染色10 min，PBS清洗2遍，干燥，拍照觀察。

1.4.4AO/EB染色接種細胞45×104/孔于6孔板中，每孔1 mL，設(shè)置空白對照孔。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，給藥組分別加入含DADAG 11.50、23.00、46.00、69.00 μg/mL 的完全培養(yǎng)基1.5 mL，空白組加入等量的培養(yǎng)基。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)。小心棄去孔內(nèi)液體，PBS沖洗2遍，每孔加入1 mL的PBS后，再加入20 μL的AO/EB混合液，染色2～3 min。倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.5細胞凋亡狀況的檢測按照“1.4.4”方法處理細胞，DADAG作用48 h后，按照細胞凋亡試劑盒說明步驟處理細胞，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.4.6RT?PCR檢測凋亡相關(guān)基因的表達按照“1.4.4”方法處理細胞，DADAG作用48 h后，提取RNA，并進行RNA的定量以及純度分析，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后的cDNA進行RT?PCR反應(yīng)?；蛐蛄衼碓从贕ene Bank，委托TaKara公司合成，Bax F：5′?GAC?GAACTGGACAGTAACATGGA?3′，R：5′?GCAAAG?TAGAAAAGGGCGACA?3′；Bcl?2 F：5′?GTTCGGT?GGGTCATGTGT?3′，R：5′?ATCCCAGCCTCCGTTA?TCCT?3′。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用表示，實驗組與空白對照組之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1DADAG對NCI?H460細胞株增殖的影響DADAG（2.88、5.75、11.50、23.00、46.00 μg/mL）對H460細胞作用48 h的OD值均較空白組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著給藥劑量的增大，給藥組OD值逐漸減小，說明藥物對細胞的增殖抑制作用逐漸增強。DADAG作用于H460細胞48 h的OD值及抑制率見表1。利用SPSS 17.0軟件概率單位法計算出DADAG對H460細胞的IC50值為24.79 μg/mL。根據(jù)計算出的IC50以及預(yù)實驗結(jié)果，初步確定以11.50、23.0、46.00、69.00 μg/mL進行后續(xù)實驗。

2.2DADAG作用后對H460細胞體外克隆形成能力的影響腫瘤細胞具有形成集落的能力，集落抑制實驗常用于抗癌藥物對腫瘤細胞增殖影響的觀察。不同濃度的DADAG作用于H460細胞后，與空白組比較，給藥組的集落形成明顯受到抑制，隨著給藥濃度的增大，抑制越來越強，見圖1。

表1　不同濃度DADAG對H460細胞的OD值以及抑制率Tab.1　The inhibitory rate and OD value of different concentration of DADAG on H460 cells　±s

表1　不同濃度DADAG對H460細胞的OD值以及抑制率Tab.1　The inhibitory rate and OD value of different concentration of DADAG on H460 cells　±s

注：與空白組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01

DADAG（μg/mL）0.00 2.88 5.75 11.50 23.00 46.00 OD 1.39±0.13 1.17±0.12*1.03±0.10*0.86±0.19**0.71±0.10**0.56±0.17**抑制率（%）0.00 15.68 25.82 38.17 49.30 59.61 48 h?IC50（μg/mL）24.79

2.3AO/EB染色觀察細胞形態(tài)變化經(jīng)方法1.4.4染色處理的各組細胞，在熒光顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)如下：（1）空白組：細胞在熒光顯微鏡下核染色質(zhì)呈綠色，且形態(tài)正常，細胞質(zhì)透亮；（2）給藥組：細胞在熒光顯微鏡下可觀察到核染色質(zhì)被呈橘紅色，且隨著給藥劑量的增加，被染成橘紅色的細胞數(shù)增多，細胞形態(tài)與空白組比較發(fā)生一定的變化，表現(xiàn)為細胞圓縮，不規(guī)則，見圖2。

圖1　不同濃度DADAG對H460細胞集落的影響Fig.1　Effects of different concertrations of DADAG on H460 cell colony

圖2　AO/EB熒光染色法觀察DADAG誘導(dǎo)H460細胞凋亡情況（200×）Fig.2　Effects of DADAG on apoptosis of H460 by AO/EB staining（200 ×）

2.4DADAG對H460細胞凋亡的影響流式細胞術(shù)檢測結(jié)果見圖3，在流式雙變量散點圖中左下象限表示活細胞，染色結(jié)果為Annexin V-PI-；左上象限表示壞死的細胞，染色結(jié)果為Annexin V-PI+；右下象限表示早期凋亡的細胞，染色結(jié)果為Annexin V+PI-；右上象限表示中晚期凋亡的細胞，染色結(jié)果為Annexin V+PI+。經(jīng)DADAG處理過的細胞總凋亡率明顯高于空白組，且隨著DADAG給藥量的增加，發(fā)生凋亡的細胞數(shù)越來越多，各組總凋亡率分別為：（5.71±0.88）%，（13.10±0.87）%，（28.94±0.44）%，（40.06±0.91）%，見圖4。

2.5DADAG對H460細胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因的影響隨著DADAG給藥濃度的增加（23.00、46.00、69.00 μg/mL）NCI?H460細胞內(nèi)Bcl?2的相對表達量減少，Bax的相對表達量增加，見圖5。

圖3　H460經(jīng)DADAG作用48 h后的細胞總凋亡分布圖Fig.3　The distrbution of cell apopotosis of H460 cell after treated with DADAG for 48 h

圖4　H460經(jīng)DADAG作用48 h后的細胞總凋亡率柱形圖（n=3，±s）Fig.4　The histogram of total cell apopotosis of H460 cell after treated with DADAG for 48 h

圖5　DADAG對NCI?H460細胞內(nèi)Bcl?2、Bax mRNA表達的影響（n=3，±s）Fig.5　Effect of DADAG on Bcl?2、Bax mRNA express of H460 Cell

3　討論

目前，關(guān)于DADAG的抗癌作用已有一些報道，但其抗癌機制還未見闡明［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，DADAG能夠顯著地抑制肺癌NCI?H460細胞增殖，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。DADAG能夠抑制H460細胞集落的形成，從染色結(jié)果可以看出，當(dāng)DADAG濃度達到69.00 μg/mL時與空白組比較，集落數(shù)明顯減少。MTT和集落實驗提示，DADAG對NCI?H460細胞的增殖有抑制作用。細胞增殖是生命的基本特征之一，是個體發(fā)育和生命延續(xù)的基本保證，其實質(zhì)是DNA的復(fù)制［13］。

細胞發(fā)生凋亡的過程中，細胞的形態(tài)會發(fā)生顯著變化，因此從細胞形態(tài)的變化分析細胞凋亡是最基本的方法。本研究根據(jù)48 h?IC50值選取了11.50、23.00、46.00、69.00 μg/mL 藥物濃度，采用AO/EB染色法進行細胞凋亡形態(tài)學(xué)的觀察。進一步用流式細胞儀定量檢測，給藥組中細胞的凋亡率隨著給藥量增加而增大。DADAG 46 μg/mL組的細胞增殖抑制率和凋亡率分別為59.61%和28.94%。該結(jié)果提示DADAG能夠引起肺癌NCI?H460細胞凋亡，但抑制NCI?H460細胞增殖作用并不完全源于其誘導(dǎo)凋亡的作用，DADAG也有可能調(diào)控NCI?H460細胞的細胞周期，使細胞周期發(fā)生阻滯產(chǎn)生一定的抑制細胞增殖作用。這一假設(shè)還需后續(xù)實驗進一步驗證。

研究［14-15］表明DADAG對肝癌細胞HLE、白血病HL?60細胞產(chǎn)生凋亡使細胞死亡。已發(fā)現(xiàn)的參與細胞凋亡的基因主要有 Bcl?2、Caspase、Bax、p53、Fas、FasL等，研究較多的一類基因是Bcl?2基因家族，Bax也屬于Bcl?2基因家族，Bax與Bcl?2分別是細胞內(nèi)重要的凋亡促進蛋白和凋亡抑制蛋白［16-18］。本研究應(yīng)用RT?PCR法檢測H460細胞凋亡結(jié)果提示DADAG能夠誘導(dǎo)肺癌細胞H460產(chǎn)生凋亡，其凋亡的機制可能與促凋亡基因Bax表達量上調(diào)，抗凋亡基因Bcl?2基因的表達量下調(diào)有關(guān)。

綜上所述，DADAG能夠抑制肺癌細胞NCI?H460的增殖，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生凋亡，作用機制可能與Bax表達量上調(diào)，Bcl?2的表達量下調(diào)有關(guān)。本研究為DADAG對肺癌細胞NCI?H460體外作用機制提供了重要的理論依據(jù)，但也存在一定的局限性，本研究目前只探討了DADAG對NCI?H460的體外作用，體內(nèi)作用還在摸索中；考察的基因表達譜較窄，外源性死亡受體途徑相關(guān)基因及蛋白表達譜的變化有待進一步研究。

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