初瑞， 欒嵐，吳非，白陽，廖鑫，王翠芳*

（1沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究生院，沈陽 110034；2沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科，沈陽 110024）

胃癌是世界上最常見的癌癥之一，是世界癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，而胃腺癌是胃癌的主要類型，盡管治療方式有所創(chuàng)新，但胃腺癌患者的死亡率依然很高[1]。因此，有必要進(jìn)一步研究胃腺癌的發(fā)生機(jī)制及分子基礎(chǔ)，采取合理設(shè)計(jì)的分子靶向治療，干預(yù)與細(xì)胞分化、增殖等相關(guān)的信號通路等措施[2]。Diversin，又稱錨蛋白重復(fù)序列包含蛋白6（Ankrd6），是果蠅屬Diego蛋白在哺乳動(dòng)物中的同系物，但它們的結(jié)構(gòu)和作用差異很大[3]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，diversin在多種腫瘤組織中存在高表達(dá)，而在癌旁及正常組織中低表達(dá)，并且diversin的高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)。目前尚未見diversin在胃腺癌組織中表達(dá)的報(bào)道。本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測胃腺癌及癌旁組織中diversin的表達(dá)及分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，有助于進(jìn)一步了解diversin在胃腺癌中的作用機(jī)制。

材料與方法

1 資料

收集沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科經(jīng)病理證實(shí)為胃腺癌的蠟塊標(biāo)本77例，標(biāo)本中患者男性55例，女性22例，年齡37歲至83歲，平均年齡63歲；腫物平均大小3.0cm；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例，無轉(zhuǎn)移者40例；腫瘤浸潤至固有層或黏膜下層15例，浸潤至肌層16例，浸潤至漿膜層46例；高-中分化胃腺癌35例，低分化胃腺癌42例；另取上述距胃癌組織≥5cm的非腫瘤性胃黏膜50例作為對照組。

2 主要試劑

鼠抗人diversin抗體（1:400）購于美國Santa Cruz公司；二抗（快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物），DAB顯色試劑盒，粉劑型PBS緩沖液，粉劑型抗原修復(fù)液均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

3 EnVision兩步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片經(jīng)烤片后，在二甲苯和梯度酒精中脫蠟和脫苯后水洗至透亮；高溫高壓修復(fù)后，PBS沖洗3×3min；加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，每張切片大約100μL，室溫孵育20min；PBS沖洗3×3min；加入一抗，每張切片約50μl，4℃冰箱內(nèi)過夜；次日取出后恢復(fù)室溫20min，PBS清洗3×3min；加入二抗，室溫孵育15min，PBS沖洗3×3min；顯微鏡下DAB顯色后自來水沖洗，蘇木素復(fù)染、分化，自來水沖洗反藍(lán)后放入梯度酒精內(nèi)脫水，最后中性樹脂封片。

4 結(jié)果判讀

Diversin在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，陽性表達(dá)為棕黃色，由兩名病理醫(yī)師進(jìn)行盲法評估，隨機(jī)選取5個(gè)100倍視野按照陽性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度二者之和評分，無染色(0分)，淺黃色(1分)，棕黃色(2分)，棕褐色(3分)；陽性細(xì)胞數(shù)：＜5% （0分），6%～25%（1分）， 26%～50%（2分）， 51%～75%（3分），＞75%（4分）。將陽性細(xì)胞百分比的計(jì)分與染色強(qiáng)度的計(jì)分相加，最后所得之和：＜2分為陰性，2～3分為弱陽性，4～5分為中度陽性，6～7分為強(qiáng)陽性。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和相關(guān)性分析。

結(jié) 果

1 Diversin在胃腺癌組織高表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色顯示，diversin在胃腺癌組織中高表達(dá)，在癌旁組織中低表達(dá)或不表達(dá)（圖1）；其在胃腺癌組織中的陽性率為70% ，在癌旁組織中的陽性率為34%（表1）。

圖1 Diversin在胃癌及癌旁組織表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測。A，高分化；B，中分化；C，低分化；D，癌旁組織；比例尺，20μmFig. 1 Immunohistochemistry examination of diversin expression in gastric cancer and adjacent tissues. A, well differentiated cancer tissue; B, moderately differentiated cancer tissue; C, poorly differentiated cancer tissue; D, normal adjacent tissue; scale bar, 20μm

表1 Diversin在胃腺癌及癌旁組織中的表達(dá)Tab. 1 Expression of diversin in gastric carcinoma and adjecent tissues

2 Diversin在胃腺癌組織中的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Diversin的陽性表達(dá)率在不同浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不同大小腫瘤中差別顯著。在浸潤深度這項(xiàng)指標(biāo)中，腫瘤浸潤至漿膜層（T3）組中diversin陽性表達(dá)39例（84.8%），顯著高于diversin在固有層(T1)及肌層(T2)的陽性表達(dá)率（40%、62.5%）；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組diversin的陽性表達(dá)有30例（81.1%），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組diversin陽性表達(dá)有24例（60%），diversin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；在腫瘤直徑≥3cm的患者中diversin陽性表達(dá)42例（77.8%），而腫瘤直徑＜3cm的患者diversin陽性表達(dá)11例（47.8%），diversin在腫瘤直徑≥3cm組的陽性表達(dá)率明顯高于腫瘤直徑＜3cm組。在不同年齡、性別，分化程度中diversin的表達(dá)無明顯差異（表2）。

表2 Diversin蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab. 2 Correlation of diversin expression with clinicopathological features of gastric cancer

討 論

近年來，胃癌在我國消化道腫瘤的發(fā)病率排名一直居于高位，盡管治療手段有所改進(jìn)，但其死亡率仍然很高。胃腺癌是胃惡性腫瘤發(fā)病率最高的類型，其5年生存率僅20%左右，胃腺癌的發(fā)生發(fā)展受多種因素參與調(diào)控，且化療等臨床手段對胃腺癌患者的治療效果不佳，所以尋找治療胃腺癌的有效基因靶點(diǎn)至關(guān)重要[4]。

Diversin也稱錨蛋白重復(fù)序列包含蛋白6（Ankrd6），小鼠diversin是由712個(gè)氨基酸所編碼的蛋白質(zhì)，它有3個(gè)功能域，分別是包含8個(gè)N末端錨蛋白重復(fù)域，保守的中心域和C末端結(jié)構(gòu)域，人類的diversin蛋白與小鼠diversin蛋白很相似[5]。

Wnt信號通路包括經(jīng)典Wnt信號通路，即Wnt/β-catenin通路，以及非經(jīng)典Wnt通路，主要包括Wnt/Ca2+及Wnt/JNK通路。近年研究證明，Wnt信號通路與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括結(jié)直腸癌，胃癌，肝癌等[6]。研究發(fā)現(xiàn)diversin與Wnt信號通路相關(guān)，其在經(jīng)典Wnt信號通路中通過抑制降解復(fù)合體對β連環(huán)蛋白的降解，從而發(fā)揮抑制經(jīng)典Wnt通路的作用[7]。在JNK通路中，diversin促進(jìn)多種與形態(tài)發(fā)生相關(guān)的事件，包括原腸胚形成過程中的匯聚延伸運(yùn)動(dòng)，斑馬魚發(fā)育過程中心臟的形成，以及細(xì)胞培養(yǎng)過程中的血管發(fā)育等[8-9]。

Luan L等[10]研究發(fā)現(xiàn)diversin在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，在正常肺組織中低表達(dá)，且diversin在肺癌組織中的高表達(dá)與分化程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期相關(guān)；與性別，年齡，組織類型不相關(guān)，且通過生存分析得知diversin陽性的非小細(xì)胞肺癌患者生存期明顯低于diversin陰性的患者；Yu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，diversin高表達(dá)于乳腺癌組織，低表達(dá)于正常乳腺組織中，且在乳腺癌中的高表達(dá)與TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，ER受體及三陰性乳腺癌相關(guān)，與年齡，性別，腫瘤大小等不相關(guān)；Wang M等[12]研究發(fā)現(xiàn)diversin在人腦星形細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)，并且與組織學(xué)分級相關(guān)，而與年齡，性別不相關(guān)；以上研究均發(fā)現(xiàn)高表達(dá)diversin的腫瘤組織中Wnt/JNK通路的關(guān)鍵蛋白JNK表達(dá)水平增高，而經(jīng)典Wnt/β-catenin通路中的β-catenin等相關(guān)蛋白表達(dá)在對照組和實(shí)驗(yàn)組中的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示diversin的作用

[1] Babacan NA, Reyhan EH, Birsen Y, et al. The Prognostic value of UHRF-1 and p53 in gastric cancer. Saudi J Gastroenterol, 2016, 22(1): 25-29.

[2] Badary DM, Abdel-Wanis ME, Hafez MZ, et al. Immunohistochemical analysis of PTEN, HER2/neu, and ki67 expression in patients with gastric cancer and their association with survival. Pathophysiology, 2017, 24(2): 99-106.

[3] Feiguin F, Hannus M, Mlodzik M, et al. The ankyrin repeat protein Diego mediates Frizzled-dependent planar polarization. Developmental Cell, 2001, 1(1): 93-101.

[4] 趙紅巖，李紅. 胃腺癌組織中LRIG1蛋白的表達(dá)及意義.腫瘤防治研究，2016，43（6）：489-491.

[5] Allache R, Wang M, De Marco P, et al. Genetic studies of ANKRD6 as a molecular switch between Wnt signaling pathways in human neural tube defects. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2015, 103(1): 20-26.

[6] Zhan T, Rindtorff N, Boutros M. Wnt signaling in cancer.Oncogene, 2017, 36(11): 1461-1473.

[7] Ikeda M, Hirota Y, Sakaguchi M, et al. Expression and pro-通路可能為JNK通路；diversin在胃腺癌中的表達(dá)及作用機(jī)制尚未見報(bào)道。

本研究中diversin在胃腺癌組織中高表達(dá)，在癌旁組織低表達(dá)，二者有顯著差異（P=0.000）。浸潤及轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特征，嚴(yán)重影響患者預(yù)后，本研究中diversin高表達(dá)者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的比率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者；在浸潤深度這項(xiàng)指標(biāo)中，diversin高表達(dá)的患者浸潤至漿膜層的比例高于浸潤至固有層及肌層。由此提示，高表達(dá)diversin的胃腺癌患者可能預(yù)后不良。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討diversin作用的具體通路及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，后續(xù)工作中我們將為diversin可能作為胃腺癌治療的新的基因靶點(diǎn)提供更有力的證據(jù)。liferation-promoting role of Diversin in the neuronally committed precursor cells migrating in the adult mouse brain.Stem Cells, 2010, 28(11): 2017-2026.

[8] Chonnettia J, Dong Q, Myoung K S, et al. Ankrd6 is a mammalian functional homolog of Drosophila planar cell polarity gene diego and regulates coordinated cellular orientation in the mouse inner ear. Dev Biol, 2014, 395(1): 62-72.

[9] Moeller H, Jenny A, Schaeffer HJ et al. Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development. Proc Natl Acad Sci USA , 2006, 103(43): 15900–15905.

[10] Luan L, Zhao Y, Xu Z, et al. Diversin increases the proliferation and invasion ability of non-small-cell lung cancer cells via JNK pathway. Cancer Letters, 2014, 344(2):232-238.

[11] Yu X, Wang M, Dong Q, et al. Diversin is overexpressed in breast cancer and accelerates cell proliferation and invasion.PLoS One, 2014, 9(5): e98591.

[12] Wang M, Yu X, Dong Q, et al. Diversin is overexpressed in human gliomas and its depletion inhibits proliferation and invasion. Tumor Biol, 2014, 35(8): 7905-7909.