李能干，史克倩，劉恒濤，劉倩倩，張晉玚，李存璽，楊同華1,*

（1昆明理工大學醫(yī)學院，昆明650504；2北京家恩德運醫(yī)院家恩遺傳實驗室，北京 100191；3云南省第一人民醫(yī)院血液科，昆明650032）

9號與22號染色體易位[t(9; 22)(q34; q11.2)]形成的衍生22號染色體[der(22)t(9; 22)(q34; q11.2)]稱費城染色體（Philadelphia chromosome, Ph），是人類腫瘤細胞中最先發(fā)現(xiàn)的染色體異常[1]。在成人急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia, ALL）中，Ph陽性病例約占20%～25%[2]。Ph陽性的慢性粒細胞白血?。╟hronic myeloid leukemia, CML）和ALL病例，Ph可發(fā)生復雜重排，形成不典型的染色體形態(tài)。ALL者發(fā)生Ph不典型等臂重排十分罕見[3,4]。我們發(fā)現(xiàn)了國內第1例成人B細胞ALL（B-ALL）攜帶等臂雙著絲粒費城染色體病例?，F(xiàn)結合文獻復習報告如下。

對象與方法

1 病例

患者，女，49歲，于2016年6月因乏力、納差伴皮膚瘀斑1周，稀水樣便腹瀉4天入院。發(fā)病時有牙齦滲血、鮮紅色血尿和血便；無發(fā)熱、咳嗽、咳痰、胸悶，無明顯嘔吐、腹痛，無頭痛、無鼻衄、口咽干燥、皮膚光敏等癥狀。血常規(guī)檢查：WBC 42.4×109/L，HGB 100g/L，PTL 8×109/L；外周血白細胞明顯增高，幼稚淋巴細胞占5%；凝血功能正常。骨髓涂片：急性淋巴細胞白血病骨髓象；流式免疫分型顯示R2群（細胞表達CD58、CD22、CD19、CD10、HLA-DR、CD34、cCD79a、部分表達CD38和CD20）約占64.6%。臨床診斷急性B淋巴細胞白血?。˙-ALL）。PCR融合基因檢測顯示BCR/ABL1(+)。

2 染色體核型分析

在患者知情同意的原則下，無菌抽取骨髓2ml，肝素鋰抗凝。室溫保存，48h內將適量骨髓樣本接種到ALL專用HD培養(yǎng)基內，5%CO2，37 ℃培養(yǎng)24h。收獲細胞前用HD550處理細胞70min；0.2g/ml秋水仙素處理20min；離心去上清，留1.5mL細胞液，加入HD低滲液處理15～17min；固定 (乙酸:甲醇=1:3)，離心去上清，留約1.5mL細胞液，混勻細胞。加入固定液，離心去上清，留約0.5mL細胞液混勻；再次加入固定液，離心去上清，留約0.2mL細胞液；加新鮮固定液制成細胞懸浮液。將細胞懸液滴在潔凈濕冷的玻片上，風干后移入烤箱，90℃烘烤2h?？竞玫牟Ｆ涍^胰酶消化、吉姆薩染色，加蓋玻片晾干。細胞遺傳學分析用HD系列試劑均為北京家恩遺傳實驗室自制。將制備好的玻片用Leica全自動玻片掃描系統(tǒng)GSL-120掃描拍攝，獲得分散的分裂中期染色體圖像。用CytoVision軟件輔助分析判讀中期細胞，核型分析，歸納結果。

3 中期細胞FISH驗證

將已經完成細胞遺傳學分析的的玻片浸入二甲苯處理30min，揭去蓋玻片。甲醇脫色處理2次，100%、80%、70%乙醇依次脫水，風干。新鮮卡那固定液固定10min，風干。甲醛后固定20min。PBS緩沖液洗3次，乙醇系列脫水，風干。按廠家（CytoCell）操作指導加入BCR/ABL1探針試劑，加蓋玻片密封。置入37℃濕盒避光過夜。用2×和0.4×SSC溶液各洗片1min。乙醇系列脫水，風干。DAPI襯染，封片。利用Leica全自動玻片掃描系統(tǒng)GSL-120記錄的坐標信息，尋找對應的經過核型分析的細胞進行拍攝、分析。

結 果

1 染色體異常核型提示克隆進化

患者骨髓樣本經過24h培養(yǎng)，拍攝200個中期分裂相細胞。詳細分析 30 個中期分裂相細胞，共發(fā)現(xiàn)5個異?？寺?。最簡單的克隆為9號染色體長臂3區(qū)4帶（9q34）與22號染色體長臂1區(qū)1帶（22q11.2）發(fā)生平衡易位（圖1）。在此基礎上，第2個克隆顯示在Ph末端出現(xiàn)同質染色區(qū)hsr(homogeneously staining region)。第3個克隆為衍生22號染色體發(fā)生復制，并在hsr遠端處相連，形成等臂雙著絲粒22號染色體idic(Ph)。第4個克隆在第3個克隆的基礎上，額外獲得1條等臂雙著絲粒22號染色體。第5個克隆在第1個克隆基礎上，Ph發(fā)生復制并在近著絲粒處相連，形成等臂衍生22號染色體ider(Ph)。其余6個細胞為正常女性核型。

ISCN格式的核型書寫為：46, XX, t(9; 22)(q34; q11.2)[7]/46, XX, der(9)t(9; 22), der(22)t(9; 22)hsr(9; 22)(q34; q11.2)[8]/46, XX, der(9)t(9; 22), idic(22)(22pter→22q11.2::9q34::hsr::9q34::22q11.2→22pter)[5]/47, XX, der(9)t(9; 22),+22, idic (22)x2[2]/46, XX, der(9)t(9; 22), ider(22)(q10)t(9; 22)[2]/46, XX[6]。

2 BCR/ABL1熒光原位雜交提示基因擴增

為確定核型分析結果，將核型分析用的玻片用二甲苯脫去蓋片，甲醇脫色，利用GSL 120 CytoVision存儲的坐標信息，對原位的中期相染色體進行了FISH驗證（圖2）。9號染色體長臂末端上的ABL1采用紅色羅丹明標記；綠色信號FITC標記22號染色體長臂末端上的BCR（圖2b, d，實心箭頭）。圖2a和2b中的空心箭頭指示Ph-hsr片段，紅綠融合信號成簇狀，表示Ph攜帶的hsr有BCR/ABL1擴增。圖2c和2d中的空心箭頭指示2條idic(Ph)染色體?？招募^指示2條idic(Ph)染色體上均有成簇的紅綠融合信號，符合Ph-hsr-Ph結構。

按照ISCN規(guī)則，F(xiàn)ISH臨床報告為：ish der(9)t(9;22)(ABL1+, BCR+), der(22)t(9; 22)(BCR+, ABL1+),der(22)t(9; 22)hsr(9; 22)(BCR amp, ABL1 amp), idic(22)(BCR amp, ABL1 amp), ider(22)(ABL1+, BCR+,BCR+, ABL1+)。

4 治療與轉歸

臨床對患者實施VP方案化療（長春新堿2mg d1、d8、d15、d22；硼替佐米 60mg d1～15，16～30逐漸減量）及對癥支持治療?；煹?4天行骨穿復查，細胞學和免疫學檢查結果提示緩解。40天后給予患者COP方案化療（長春瑞賓30.00mg d1，環(huán)磷酰胺 1.10g d1，氫化潑尼松60.00mg d7），第41天行鞘內注射（甲氨蝶呤15.00mg，地塞米松5.00mg）。5個月后，患者病情惡化，出血、咳血、便血、尿血，胸骨后陣發(fā)絞痛，伴發(fā)嚴重感染，多器官功能衰竭，死亡。

圖1患者ALL腫瘤細胞克隆之間演化圖。每個方框內左半邊為異常細胞系中的22號染色體實圖（最左為正常22號，紅色箭頭示異常22號）；右半邊為相應的染色體模式示意圖；干系克隆有典型的Ph；旁系1（I級）表現(xiàn)在費城染色體末端連接一段同質染色區(qū)（ hsr ）；旁系1（II級）可見I級中的Ph染色體長臂末端尾尾相連，形成等臂雙著絲粒費城染色體[idic(Ph)] ；旁系1（III級）中出現(xiàn)兩條idic(Ph)；旁系2（I級）表現(xiàn)為完全不同的近著絲粒區(qū)域相連的等臂衍生費城染色體ider(Ph)Fig.1 Diagram of ALL clonal cell evolution. The representative 22nd chromosomes of every abnormal clones (left) and their schematic diagrams (right)are shown in the boxes, where the normal homologous chr22 is always put on the very left, while the abnormal ones are pointed by red arrows on the right side. The stem line carries a typical Philadelphia chromosome. The fi rst sideline evolves into 3 classes: sideline 1-I was characterized by an homogeneous staining region at the end of Ph chromosome (Ph-hsr); sideline 1-II formed an isodicentric Ph-hsr-Ph structure [idic(Ph)]; idic(Ph) was duplicated in sideline 1-III. The 2nd sideline (class I) was featured by an entirely different isobrachial and derivative Ph chromosome connected with the pericentromeric region

討 論

腫瘤細胞染色體核型演化一般遵從由簡單結構變異到復雜畸變的規(guī)律，干系克隆是僅攜帶最基本變異的細胞系。本例患者染色體核型分析發(fā)現(xiàn)5個異?？寺?。第1個克隆僅攜帶9號染色體長臂3區(qū)4帶與22號染色體長臂1區(qū)1帶發(fā)生平衡易位，形成典型Ph，為干系克隆。第2個克隆在干系的基礎上，Ph末端出現(xiàn)同質染色區(qū)hsr，提示BCR/ABL1發(fā)生了擴增,經FISH驗證有成簇BCR/ABL1信號，符合融合基因擴增現(xiàn)象[4,5]，確認形成了旁系1（I級）。在旁系1（I級）變異的基礎上，衍生22號染色體發(fā)生復制并在hsr遠端尾尾相連，經用BCR/ABL1探針FISH驗證，形成梭形的等臂雙著絲粒費城染色體idic(Ph)，形成第3個克隆，為旁系1（II級）。第4個克隆由旁系1（II級）細胞再次發(fā)生染色體復制，形成2條等臂雙著絲粒費城染色體，屬于旁系1（III級）；但不排除首先形成2條等臂雙著絲粒費城染色體，在細胞增殖過程中部分細胞丟失了1條的可能性。此外，我們還發(fā)現(xiàn)旁系2克隆，其在干系基礎上，Ph直接發(fā)生復制并在近著絲粒處相連，形成了沙漏形的等臂衍生費城染色體ider(Ph)。基于分子和細胞遺傳學的實驗結果和上述分析，我們認為該患者白血病細胞呈進行性演化（發(fā)展模式見圖1）。

Ramachandran等[6]報道了2例帶有Ph等臂復制的CML病例，同時總結了之前公開報道過的13例類似病例。這15例Ph發(fā)生等臂復制的病例中，14例為CML，僅1例為ALL[3]。其中惟一1例ALL為Yamamoto等[3]2007年報道的，是世界上第1例成人B-ALL攜帶idic(Ph)的病例，但該患者同時還攜帶了其他染色體畸變der(7;12)(q10;q10)。Yamamoto認為idic(Ph)染色體中間的片段僅來源于9q34-9qter。Koka等[4]（2017）報道的首例T-ALL單獨攜帶idic(Ph)與本例一樣，經SNP微陣列芯片證實，同樣有Ph-hsr-Ph的結構。迄今文獻可查的帶有等臂復制費城染色體的病例報告總結見表1。所有這些病例報告中，Ph長臂末端相連的idic(Ph)，僅有5例CML[7-10]及2例ALL[3,4]，其余均為來自CML患者的、結構特征為著絲粒區(qū)域或短臂相連的ider(Ph)。

圖2 骨髓有絲分裂中期細胞利用核型技術與FISH技術對應分析BCR/ABL1信號。紅色信號指示9號染色體上的ABL1基因；綠色信號為22號染色體上的BCR基因（B，D，實心箭頭）；A空心箭頭指示連接hsr片段的Ph染色體，B空心箭頭所指成簇的紅綠融合信號表示Ph染色體攜帶hsr為BCR/ABL1擴增；C，空心箭頭指示兩條idic(Ph)染色體，均為Ph-hsr-Ph結構。D，空心箭頭指示兩條idic(Ph)染色體上均有成簇的紅綠融合信號Fig. 2 Karyotyped bone marrow cells at metaphase were hybridized with the BCR/ABL1 FISH probes on the same cells. A, arrow pointed at Ph-hsr; B,hollow arrow pointed at clustered red/green fusion signals indicating BCR/ABL1 ampli fi cation; C, arrows pointed at two idic(Ph). Both were Ph-hsr-Ph; D, hollow arrows pointed at two idic(Ph)s with clustered red/green fusion signals; ABL1 gene in chromosome 9 was marked in red and BCR gene in chromosome 22 in green (B, D, solid arrows)

成人B-ALL患者攜帶Ph較常見，為25%左右，但此前尚未見單獨攜帶idic(Ph)的報道。本例不僅是第1例B-ALL患者單獨攜帶idic(Ph)（未涉及除9號與22號之外其他染色體的異常），且表現(xiàn)出了清晰的克隆演化過程（圖1）。通過核型分析，結合FISH技術，可以5～6天內直觀、快速顯示BCR/ABL1拷貝數(shù)不斷增加的發(fā)展過程，為臨床提供治療和判斷預后的準確依據。

Ph復制、重排形成idic(Ph)，導致BCR/ABL1融合基因拷貝數(shù)增多，融合基因酪氨酸激酶活性高度增加，可能是導致白血病細胞過度增殖的機制。Gorre等[11]研究指出，BCR/ABL1融合基因的拷貝數(shù)增加，可引起藥物耐受。在CML中幾乎都有Ph，但idic(Ph)融合基因拷貝數(shù)增加的病例并不多見，在ALL患者中，尤其罕見。本例患者化療初始表現(xiàn)出緩解跡象，病情突然惡化而死亡。臨床上未給予酪氨酸激酶抑制劑TKI聯(lián)合化學藥物進行治療。

攜帶idic(Ph)的腫瘤細胞對藥物的耐受機制研究仍然是空白。通過細胞遺傳學檢查盡早發(fā)現(xiàn)idic(Ph)，及時結合TKI藥物，針對BCR/ABL1融合基因的酪氨酸激酶過表達進行治療，有可能幫助Ph+ALL患者取得更佳療效。

表1文獻報道的等臂復制費城染色體病例總結

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