楊希營(yíng)，唐靖，李浩然，孫麗娜，李鋒杰，雋兆東*

（濰坊醫(yī)學(xué)院，1麻醉學(xué)系，2山東省醫(yī)藥衛(wèi)生臨床麻醉重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3臨床醫(yī)學(xué)院，濰坊 261053）

布比卡因是神經(jīng)阻滯常用的酰胺類局麻藥，誤注入血、吸收過快或患者代謝異常可以導(dǎo)致毒性反應(yīng)，嚴(yán)重者心臟停搏，單獨(dú)使用腎上腺素復(fù)蘇甚為困難，可產(chǎn)生嚴(yán)重的肺水腫[1]。美國心臟協(xié)會(huì)(AHA)2015年心肺復(fù)蘇與心血管急救更新指南推薦脂肪乳劑和腎上腺素用于布比卡因?qū)е滦呐K停搏的復(fù)蘇[2]。但應(yīng)用時(shí)機(jī)和劑量仍存在爭(zhēng)議，復(fù)蘇成功率也存在巨大差別[3-5]。本研究前期在山羊布比卡因未停跳毒性反應(yīng)模型上發(fā)現(xiàn)，脂肪乳劑聯(lián)合腎上腺素相比單獨(dú)使用腎上腺素能縮短心功能的恢復(fù)時(shí)間[6]。但是脂肪乳劑和腎上腺素在心臟停搏復(fù)蘇中是否具有協(xié)同作用未見報(bào)道。因此，本研究擬采取開胸心臟按壓復(fù)蘇的方法改進(jìn)山羊布比卡因毒性反應(yīng)模型，排除缺氧、按壓無效等因素的干擾，探討更加合理有效的布比卡因心臟停搏復(fù)蘇方法。

材料和方法

1 動(dòng)物分組與處理

10～12月齡山羊18只，雌雄不限，濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：脂肪乳劑（lipid，L）組、腎上腺素（epinephrine，E）組、脂肪乳劑+腎上腺素（lipid + epinephrine，LE）組，每組6只。

動(dòng)物模型的建立：氯胺酮15mg/kg 肌肉注射后開放頸靜脈。丙泊酚2mg/kg、芬太尼3μg/kg、維庫溴銨0.1mg/kg靜脈誘導(dǎo)后氣管插管，七氟烷和芬太尼維持合適的麻醉深度。右側(cè)臥位開胸暴露心臟。血壓穩(wěn)定10min后開始5mg/kg/min速度靜脈泵注0.75%布比卡因直至心臟停搏。

復(fù)蘇措施：E組每3min靜脈注射腎上腺素10μg/kg，血壓超過基礎(chǔ)值并穩(wěn)定后繼續(xù)泵注維持灌注壓；L組1min內(nèi)靜脈注射20%脂肪乳劑1.5ml/kg，之后恒速15ml/kg/h持續(xù)泵注； LE組同步實(shí)施L組和E組的復(fù)蘇措施。

2 反相高效液相色譜法檢測(cè)血漿布比卡因濃度

布比卡因輸注完畢后，每10min經(jīng)股動(dòng)脈采集血液樣品1.5ml，2500r/min離心15min分離出血漿，參照文獻(xiàn)[5]初步處理后，溫度35℃，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，布比卡因樣品，濃度為16μg/ml，乙腈：0.02mmol/L磷酸水溶液=30:70，流速1ml/min，進(jìn)樣20μl。

3 透射電鏡觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取部分左心室前壁組織，用2.5%戊二醛作前固定，1%鋨酸后固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，Epon 812包埋，制備超薄切片，電子染色后在HL-7500型透射電鏡下觀察，觀察心肌細(xì)胞線粒體的變化。

4 乳酸脫氫酶組織化學(xué)染色

4.1 作用液配制

硝基蘭四氮鹽 25mg，0.01mol/L磷酸緩沖液（pH7.2）25ml，DL乳酸鈉（純度60%） 3ml，調(diào)整至pH7.4，取作用液1ml加入5mg NAD。

4.2 染色步驟

新鮮組織稍固定，恒溫箱制作冰凍切片，厚6～8μm；冰凍切片經(jīng)蒸餾水洗后入作用液，于37℃溫箱中孵育1h。將切片從作用液中取出，經(jīng)蒸餾水洗，濾紙吸干，甘油明膠封片，鏡下觀察拍照。

5 圖像分析

采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)所得圖像進(jìn)行分析，每組切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野 （40倍物鏡），測(cè)定每個(gè)視野下的平均光密度作為該組的測(cè)量值。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，不同時(shí)段不同分組間的比較用重復(fù)測(cè)量的方差分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用Fisher精確概率檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 靜脈注射布比卡因后山羊的心臟毒性

三組動(dòng)物體重、麻醉誘導(dǎo)藥物用量、手術(shù)出血量、注射布比卡因前血壓、心率、血氧飽和度和布比卡因的單位體重用量無差別（表1）。布比卡因的心臟毒性表現(xiàn)為劑量依賴性的心電傳導(dǎo)阻滯，心率減慢，心肌收縮力減弱，心腔被動(dòng)擴(kuò)大，心臟表面血管擴(kuò)張，血壓下降。最終心電靜止，心臟停搏于舒張期。

表1各組動(dòng)物體重、收縮壓、心率、血氧飽和度和出血量對(duì)比Tab. 1 Comparisons of body weight, systolic blood pressure, heart rate, blood oxygen saturation and bleeding volume in groups

2 脂肪乳劑和腎上腺素在山羊心臟復(fù)蘇中作用的比較

三組注射布比卡因完畢即刻的血藥濃度平均為440μg/ml，前20min下降最為迅速，在注射完20min時(shí)脂肪乳劑組和脂肪乳劑+腎上腺素組布比卡因血漿濃度均低于腎上腺素組。注射完30min以后，三組的血藥濃度差別逐漸縮?。▓D1）。腎上腺素組6只山羊只有一只自主循環(huán)恢復(fù)，而其他兩組6只動(dòng)物均復(fù)蘇成功，脂肪乳劑組和脂肪乳劑+腎上腺素組復(fù)蘇成功率高于腎上腺素組。脂肪乳劑+腎上腺素組復(fù)蘇（17±4.7）min后自主循環(huán)恢復(fù)，血藥濃度平均為（3.63±0.9）μg/ml；L 組復(fù)蘇（55±5.8）min 后自主循環(huán)恢復(fù)，血藥濃度平均為（1.02±0.2）μg/ml；與腎上腺素組比較，脂肪乳劑組自主循環(huán)恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，脂肪乳劑+腎上腺素組自主循環(huán)恢復(fù)時(shí)間縮短（圖2）。

圖1 靜脈注射布比卡因后布比卡因血漿濃度變化趨勢(shì)。*，與E組比較，0.01＜P＜0.05Fig. 1 Plasma concentrations of bupivacaine. *, 0.01＜P＜0.05, compared with E group

圖2 三組動(dòng)物的自主循環(huán)恢復(fù)時(shí)間比較。*，與E組比較，0.01＜P＜0.05Fig. 2 Comparison of spontaneous circulation recovery time. *,0.01＜P＜0.05, compared with E group

3 心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)學(xué)變化

透射電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示：腎上腺素組心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目較少，大部分線粒體腫脹、受損，表現(xiàn)為線粒體髓樣變或空泡樣變；脂肪乳劑組和脂肪乳劑+腎上腺素組心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量多于腎上腺素組，線粒體嵴正常，僅見部分線粒體腫脹，局部出現(xiàn)髓樣變或空泡樣變（圖3）。

圖3心肌細(xì)胞線粒體變化的透射電鏡觀察。E，腎上腺素組，箭頭示空泡樣變線粒體；L，脂肪乳劑組，箭頭示部分受損線粒體；LE，脂肪乳劑+腎上腺素組，箭頭示線粒體；比例尺，0.5μmFig.3 Transmission electron microscopic observation on mitochondrial change of myocardial cells. E, epinephrine group, arrow points to the vacuolated mitochondrion; L, lipid group, arrows point to damaged mitochondria; LE, lipid + epinephrine group, arrows point to mitochondria; scale bar, 0.5μm

4 乳酸脫氫酶活性變化

乳酸脫氫酶組織化學(xué)染色顯示，腎上腺素組山羊心肌乳酸脫氫酶（LDH）染色呈深藍(lán)紫色，顆粒粗大，且局部深染，表示LDH活性較高；脂肪乳劑組和脂肪乳劑+腎上腺素組山羊心肌染色較淺淡，顆粒較小且分布均勻，未見明顯深染區(qū)域，表明LDH酶活性較低（圖4，表2）。

討 論

本研究采用布比卡因誘導(dǎo)的山羊在體心臟停搏模型[6]，心臟停搏后心臟按壓是重要的復(fù)蘇措施[7]。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，山羊通過人工胸外心臟按壓難以提供有效的灌注壓，容易出現(xiàn)肋骨骨折等嚴(yán)重并發(fā)癥。而全身麻醉下開胸暴露心臟對(duì)循環(huán)影響小，出血量可控，不僅可以直視觀察大劑量布比卡因靜脈注射引起心臟停搏和復(fù)蘇的過程，而且通過胸內(nèi)心臟按壓可以感知心臟最初復(fù)跳和外周血管阻力的變化，增加心輸出量，促進(jìn)自主循環(huán)恢復(fù)[8]，有利于比較腎上腺素和脂肪乳劑的作用。

圖4 乳酸脫氫酶組織化學(xué)染色。E，腎上腺素組；L，脂肪乳劑組；LE，脂肪乳劑+腎上腺素組；比例尺，20μmFig. 4 Lactate dehydrogenase levels shown using histochemical staining. E, epinephrine group; L, lipid group; LE, lipid + epinephrine group; scale bar, 20μm

表2 乳酸脫氫酶活性分析Tab. 2 Quantitation of lactate dehydrogenase activity

本研究顯示，心功能的抑制和布比卡因劑量的增加具有良好的相關(guān)性。表現(xiàn)為布比卡因劑量依賴性的心率減慢，收縮乏力，繼而心腔擴(kuò)大，表面血管極度擴(kuò)張，心臟停搏于舒張期。腎上腺素對(duì)局麻藥誘導(dǎo)心搏停止的復(fù)蘇作用存在爭(zhēng)議。Harvey等[9]認(rèn)為腎上腺素是復(fù)蘇布比卡因心臟毒性不可缺少的條件，但 CAVE等[10]在布比卡因誘導(dǎo)的兔心臟停搏模型中，應(yīng)用脂肪乳劑復(fù)蘇20min的生存率達(dá)50%，而本研究脂肪乳劑組自主循環(huán)全部恢復(fù)。原因不僅和動(dòng)物類型有關(guān)，更可能是因?yàn)槲覀冊(cè)O(shè)計(jì)的模型實(shí)施了全身麻醉，進(jìn)行100%氧機(jī)械控制通氣，胸內(nèi)心臟按壓能夠輕松提供≥60mmHg的灌注壓，外周組織灌注相對(duì)充分，為保持長(zhǎng)時(shí)間按壓過程中內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和布比卡因的代謝提供了條件。而脂肪乳劑組自主循環(huán)恢復(fù)時(shí)布比卡因的平均血藥濃度1.02μg/ml則可能是心臟復(fù)跳的閾值。也有研究[10]認(rèn)為腎上腺素并不能有效治療局麻藥的心臟毒性。而脂肪乳劑+腎上腺素組不僅自主循環(huán)全部恢復(fù)，而且恢復(fù)時(shí)間短于脂肪乳劑組，恢復(fù)時(shí)的布比卡因平均血藥濃度也高于脂肪乳劑組，說明腎上腺素的β受體激動(dòng)作用能夠加快脂肪乳劑對(duì)布比卡因誘導(dǎo)的心臟停搏復(fù)蘇作用，這與Liu等[11]的研究一致。腎上腺素和脂肪乳劑在本復(fù)蘇研究中表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。本研究腎上腺素組復(fù)蘇成功率較低，原因可能與布比卡因和心肌細(xì)胞結(jié)合緊密，結(jié)合時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞本身損傷更加嚴(yán)重有關(guān)，我們通過線粒體和乳酸脫氫酶的研究觀察到這一現(xiàn)象。腎上腺素組心肌細(xì)胞相比另外兩組，不但線粒體的數(shù)目較少，而且線粒體腫脹，局部髓樣變或空泡樣變受損更加明顯。李振輝等[12]等在離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞模型也觀察到類似的現(xiàn)象。心肌組織中乳酸脫氫酶含量比其他組織明顯偏高，是心肌細(xì)胞代謝過程中比較敏感的指標(biāo)[13]，可提示無氧代謝和活性狀態(tài)[14]。腎上腺素組乳酸脫氫酶活性較高，可能與該組心肌細(xì)胞正常形態(tài)的線粒體數(shù)目較少，功能受到抑制，無氧酵解增加有關(guān)。

本研究的不足之處是沒有分析山羊心肺復(fù)蘇過程中內(nèi)環(huán)境的變化，也沒有進(jìn)行心肌細(xì)胞其他代謝指標(biāo)的檢測(cè)來反映脂肪乳劑對(duì)能量代謝的支持作用。這將在以后的研究中進(jìn)一步完善。

綜上所述，脂肪乳劑的“脂質(zhì)相萃取”效應(yīng)能夠加速布比卡因的清除，腎上腺素能夠加快布比卡因?qū)е碌男呐K停搏自助循環(huán)的恢復(fù)，二者合理應(yīng)用具有協(xié)同作用。

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