胡怡琦，樓佳棟，潘文潔，金歆怡，盧建良，錢國英*，王偉*

（1浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江省重中之重學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，寧波 315100；2浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州310018）

中華鱉（Pelodiscus sinensis）是爬行綱、龜鱉目、鱉科、鱉屬的代表動(dòng)物之一，具有季節(jié)性生殖周期[1]。中華鱉是具有冬眠習(xí)性的爬行動(dòng)物，精子的發(fā)生也具有明顯的季節(jié)性。研究表明雄性和雌性的生殖周期并不同步，在一年的不同時(shí)期分別產(chǎn)生雌雄配子[2]。前期的研究表明雄性精子發(fā)生始于4、5月份，在8、9月份時(shí)正處于高峰期，直至11月末停止，然后精子一次性釋放到附睪中儲存起來[3]。但是冬眠期是否就是精子發(fā)生的靜止期，冬眠期是否存在著精子釋放尚不清楚。

肌酸激酶（creatine kinase，CK）是胍基磷酸轉(zhuǎn)移酶家族的一員，在ATP能量快速轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要的作用[4-7]。CK主要定位于ATP快速再生的細(xì)胞中，主要參與離子泵轉(zhuǎn)運(yùn)、磷酸肌酸穿梭、肌肉收縮、ATP再生、吞噬細(xì)胞吞噬、糖酵解調(diào)控以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[8-10]。精子中能量的利用和生成是密切偶聯(lián)的，CK可催化肌酸（creatine）和腺苷三磷酸（ATP）生成磷酸肌酸（CP）和腺苷二磷酸（ADP）的可逆反應(yīng)，為細(xì)胞提供及時(shí)的能量儲存，是精子能量合成及運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵酶[11]。但是，CK與中華鱉精子發(fā)生的關(guān)系鮮有報(bào)道。研究冬眠前后CK在中華鱉睪丸曲細(xì)精管中的表達(dá)定位，對于研究中華鱉精子發(fā)生的能量供應(yīng)具有積極的意義。

本研究以9月、12月和來年3月的性成熟中華鱉為研究對象，對曲細(xì)精管生精上皮的組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行分析，探討精子發(fā)生和釋放的規(guī)律。同時(shí)，采用免疫組織化學(xué)方法分析CK在冬眠前后的組織表達(dá)規(guī)律，探討CK在精子發(fā)生中的作用。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理及樣品采集

性成熟雄性中華鱉購自浙江余姚某水產(chǎn)養(yǎng)殖場。分別于當(dāng)年9月、12月和第二年3月進(jìn)行取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取3只。其中12月份和3月份為冬眠期樣品，在室外水族箱中完成自然冬眠。中華鱉屠宰后取睪丸組織，切成約5mm見方的小塊，在4%多聚甲醛中固定24h后用于組織學(xué)分析。

2 石蠟切片制作及HE染色

將固定后的睪丸組織經(jīng)過梯度乙醇脫水處理，在透明和浸蠟后進(jìn)行石蠟組織包埋。修塊后進(jìn)行7 μm組織切片（RM 2125，徠卡，德國），并于40°C水浴中進(jìn)行攤片和展片；隨后用APES處理后的載玻片進(jìn)行撈片，并在烤片機(jī)上烘干12h（40°C）。進(jìn)行常規(guī)HE染色（無毒環(huán)保蘇木素-伊紅（H-E）染液D006，南京建成生物，中國），最后用中性樹膠封片進(jìn)行觀察。

3 CK的免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片脫蠟、止水后，經(jīng)過3% H2O2甲醇-PBS溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，用0.01mol/L枸櫞酸緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原熱修復(fù)后用5% BSA進(jìn)行封閉，隨后滴加生物素化山羊抗兔IgG一抗，具體 為 CK-B（ab151579，Abcam，USA，1:200），CK-M（ab151465，Abcam，USA，1:200），CK-S（ab189314，Abcam, USA，1:250）。孵育后進(jìn)行SABC反應(yīng)（SA1022，博士德，中國），DAB顯色后用顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。

結(jié) 果

1 冬眠前后精子發(fā)生的顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

通過比較冬眠前后精子發(fā)生的情況，我們發(fā)現(xiàn)9月份睪丸曲細(xì)精管上皮細(xì)胞包含大量的初級精母細(xì)胞和精子細(xì)胞，大量發(fā)育中的精子在管腔中呈“穗狀”排列（圖1A-1C）。12月份睪丸曲細(xì)精管中，幾乎不見初級精母細(xì)胞，但是管腔中還存在大量的精子，以及正在發(fā)生變形的精子（圖1D）。在3月份的睪丸曲細(xì)精管中，管腔中存在少量的精子，幾乎不見初級精母細(xì)胞和變形中的精子（圖1E）；但是在曲細(xì)精管之間交界的基質(zhì)處，精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞數(shù)量已開始增多（圖1F）。

圖1 中華鱉冬眠后的精子發(fā)生。A-C，9月份睪丸曲細(xì)精管，大量發(fā)育中的精子呈“穗狀”排列；D，12月份睪丸曲細(xì)精管，管腔中存在大量的精子，及正在變形的精子（紅色圓圈中標(biāo)示）；E和F，3月份的睪丸曲細(xì)精管，管腔中存在少量的精子，圖F可見靠近基質(zhì)部分的精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞數(shù)量開始增多；L，管腔；SC，支持細(xì)胞；S，精原細(xì)胞；PS，初級精母細(xì)胞；SS，次級精母細(xì)胞；Sd，精子細(xì)胞；Sz，精子；比例尺：A, 75μm; B-F, 25μmFig.1 Spermatogenesis of Pelodiscus sinensis after hibernation. A to C, a large amount of developing sperms were arranged in spike-like pattern in seminiferous tubule of testis collected in September; D, in December samples, there were lots of sperm and some metamorphic sperms (marked by the red circle) in the lumen of seminiferous tubule; E and F, a small number of sperms existed in the lumen of seminiferous tubule collected in next March;F, the number of spermatogonia and primary spermatocytes near stroma began to increase; L, lumen; SC, sertoli cell; S, spermatogonia; PS, primary spermatocytes; SS, secondary spermatocyte; Sd, spermartid; Sz, spermatozoon; scale bar, 75μm in A and 25μm in B to F

2 冬眠前后睪丸中CKs表達(dá)特點(diǎn)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CKs在不同月份的睪丸中的表達(dá)定位不同。在9月份的睪丸中（圖2A-2C），精子發(fā)生處于活躍期，CK-S在曲細(xì)精管上皮細(xì)胞中廣泛大量表達(dá)，而CK-B只是微量表達(dá)；CKM的表達(dá)主要在精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞。在12月份的睪丸中（圖2D-2F），精子發(fā)生基本處于停滯階段，CK-B主要在精原細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；而CK-M的表達(dá)主要集中在精原細(xì)胞內(nèi)及胞外，同時(shí)在管腔中也有表達(dá)；值得注意的是，CK-S的表達(dá)雖具有廣泛性，但是在充滿精子的管腔中表達(dá)量很高。在3月的睪丸中（圖2G-2I），3種CK亞型的表達(dá)方式和12月份相似，但是管腔內(nèi)的精子數(shù)量顯著減少。因此，CK亞型在不同月份中也表現(xiàn)出不同的表達(dá)方式。CK-B和CK-M在冬眠后主要在精原細(xì)胞中表達(dá)，而CKM和CK-S在胞外和曲細(xì)精管管腔中也大量表達(dá)。

圖2不同CK亞型在曲細(xì)精管中的表達(dá)定位分析。A-C，在9月份CK-M和CK-S在曲細(xì)精管中廣泛大量表達(dá)；D-F，在12月份的精母細(xì)胞中三種亞型的CK均大量表達(dá)，在曲細(xì)精管的管腔中可見大量正在變形的精子（紅色圓圈內(nèi)）；G-I，3月份的曲細(xì)精管上皮細(xì)胞，三種CK亞型的表達(dá)方式和12月份相似；S，精原細(xì)胞；PS，初級精母細(xì)胞；SS，次級精母細(xì)胞；Sd，精子細(xì)胞；Sz，精子）；比例尺，25μmFig. 2 Localization and tissue expression analysis of CKs. A to C, in September, CK-M & S were extensively expressed in the seminiferous tubule; D to F, in December, all three CKs were extensively expressed in spermatocyte cells, and many metamorphic sperm cells were observed (marked by the red circle); G to I, in March, the patterns of CKs expression were similar to December; S, spermatogonia; PS, primary spermatocytes; SS, secondary spermatocyte; Sd, spermartid; Sz, spermatozoon; scale bar, 25μm

討 論

在中華鱉冬眠前的9月份，生精上皮的精子發(fā)生非?；钴S，曲細(xì)精管內(nèi)可見大量發(fā)育中的精子呈“穗狀”排列。而到了冬眠期，精子發(fā)生趨于靜止，不僅“穗狀”排列的精子消失，曲細(xì)精管內(nèi)也鮮有精母細(xì)胞存在。但是冬眠期的精子發(fā)生并不是完全停止的—12月份的曲細(xì)精管內(nèi)含有大量的精子，生精上皮內(nèi)還存在處于變形階段的精子；而到了3月份，曲細(xì)精管內(nèi)僅有少量的精子存在，且處于變形階段的精子幾乎看不到。因此，中華鱉冬眠后精子的發(fā)生并不是完全停止的。雖然這與Zhang等[12]所描述的不完全一致，但是冬眠期精子的發(fā)生還是趨于靜止的狀態(tài)，精母細(xì)胞的數(shù)量也變得稀少。

關(guān)于中華鱉精子釋放的方式，通常認(rèn)為是在冬眠前一次性排放到附睪中。但是，我們觀察到從12月份到來年的3月份，不僅僅是發(fā)育中的精子數(shù)量在減少，曲細(xì)精管內(nèi)游離的精子數(shù)量也在減少。如果說精子的釋放每年只有一次，那么就不會出現(xiàn)精子數(shù)量減少的情況。根據(jù)這個(gè)現(xiàn)象，我們推測精子的釋放方式可能是一年多次的，即使是處于冬眠階段。

能量代謝關(guān)鍵基因CKs的免疫組化結(jié)果顯示，CKs在生精上皮中廣泛和大量表達(dá)，且不同亞型的

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