俞晨，張俊強(qiáng)，曹威，王高遠(yuǎn)，汪陶榮 ，殷瞳昕，陳曉宇*

（1皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院護(hù)理學(xué)系，六安 237000；2安徽醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，3安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，合肥 230022）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是慢性關(guān)節(jié)滑膜炎癥，表現(xiàn)為慢性、系統(tǒng)性和破壞性的自身免疫性關(guān)節(jié)疾病。RA患者表現(xiàn)為成纖維樣滑膜細(xì)胞（ fi broblast- like synoviocytes，F(xiàn)LS）類腫瘤樣生長(zhǎng)致關(guān)節(jié)局部結(jié)構(gòu)破壞[1]。研究證實(shí)[2]，RA患者機(jī)體存在的氧化應(yīng)激狀態(tài)，且促進(jìn)滑膜組織增生。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是從葡萄、虎杖等植物中提取的多元酚類植物抗毒素，具有抗炎、抗氧化、抗老化和預(yù)防腫瘤的特性[3]。本研究旨在進(jìn)一步探討Res對(duì)RA患者的抗氧化作用以及自噬在其中的影響。

材料與方法

1 試劑和主要儀器

白藜蘆醇（純度≥99%，美國(guó)Aladdin公司）；30%H2O2（北京萬(wàn)佳首化生物科技有限公司）；CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒（日本同仁化學(xué)公司產(chǎn)品）；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）（美國(guó)Gibco公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白試劑定量盒（美國(guó)Pierce公司）；兔抗人LC3 I/II和兔抗人beclin-1（美國(guó)abcam公司）；TUNEL染液、青鏈霉素溶液、蛋白預(yù)染Maker、一抗稀釋液、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG和ECL化學(xué)發(fā)光液（碧云天生物有限公司）；硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜（美國(guó)Millipore公司）；半干轉(zhuǎn)膜儀（大連競(jìng)邁生物科技有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

2 MDA、SOD和GSH-Px分光光度計(jì)檢測(cè)

抽取住院RA患者空腹靜脈血，離心后置于-20℃冰箱中保存待測(cè)。按照說(shuō)明書操作程序進(jìn)行MDA含量硫代巴比妥酸法、SOD活性羥胺法和GSH-Px活性比色法檢測(cè)，進(jìn)行。同時(shí)，取同期門診健康體檢正常人血清作為對(duì)照，RA患者和正常人一般情況，包括年齡、性別等差異無(wú)顯著性，兩組具有可比性。實(shí)驗(yàn)過(guò)程患者和健康體檢者知情同意。

3 滑膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)

采取組織塊培養(yǎng)法，參照文獻(xiàn)[4]并改進(jìn)。RA患者膝關(guān)節(jié)鏡無(wú)菌下取出的滑膜組織，剪成約1mm3大小碎塊，含10%FBS的Ⅱ型膠原酶消化約2h；0.25%的胰蛋白酶消化，將細(xì)胞重懸于含15% FBS的DMEM培養(yǎng)液, 吹打均勻接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3～4d換液1次。待細(xì)胞長(zhǎng)至≥70%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為第3～5代。

4 細(xì)胞增殖的CCK-8法檢測(cè)

將RA-FLS接種于96孔板中，每孔加入100μl細(xì)胞數(shù)為2.0×103個(gè)，每組設(shè)4復(fù)孔，次日細(xì)胞貼壁后加藥處理。設(shè)不同濃度的H2O2處理組（0、1、5、10、20、40、80、100μmol/L）預(yù)先處理FLS 24h后，每孔加入10μl CCK-8工作液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處吸光度A值。

5 RA-FLS凋亡的TUNEL法檢測(cè)

嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書，采用原位末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)FLS的凋亡情況。將RA-FLS接種于6孔板中，轉(zhuǎn)移至玻片，培養(yǎng)24h，孵育5 μmol/L H2O212h，Res孵育24h，PBS洗10min×3遍，并用反應(yīng)緩沖液37°C 下暗室中孵育30min。蘇木精復(fù)染顯示細(xì)胞核，凋亡細(xì)胞被染成棕色。

6 自噬相關(guān)蛋白的Western blot檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RA-FLS按照2×105/孔細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度約80%時(shí)，如上加藥處理24h后，用RIPA裂解液提取總蛋白，4℃、12000r/min離心5min；取上清液，BCA蛋白試劑盒蛋白定量，SDS-PAGE電泳（分離膠10% , 濃縮膠5%），半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜1h，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，4℃孵育LC3I/II、beclin-1抗體過(guò)夜，TBST洗膜10min×3次，二抗室溫孵育2h，TBST洗膜10min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光，曝光壓片，顯影、定影。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 白藜蘆醇抑制RA患者血清中MDA含量增加與SOD和GSH-Px活性降低

與正常健康體檢者比較，RA患者血清中MDA含量明顯升高，SOD和GSH-Px活性顯著降低，差異有顯著性（表1），即RA患者氧化應(yīng)激增強(qiáng)。

表1 RA患者血清MDA含量與SOD和GSH-Px活性Tab. 1 Serum MDA levels and the activities of SOD and GSH-Px in RA patients

2 H2O2對(duì)RA-FLS細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測(cè)RA-FLS細(xì)胞增殖情況顯示，給予不同濃度的H2O2處理24h后（將以0μmol/L H2O2處理的對(duì)照組細(xì)胞活力設(shè)為100%），1～5μmol/L H2O2可促進(jìn)RA-FLS細(xì)胞增殖，當(dāng)H2O2濃度繼續(xù)升高，RA-FLS細(xì)胞增殖活力逐漸降低，當(dāng)H2O2濃度達(dá)100μmol/L，RA-FLS細(xì)胞活力幾乎為零（圖1）。故在體外實(shí)驗(yàn)中，我們選擇低濃度（5μmol/L）H2O2作為刺激RA-FLS細(xì)胞生長(zhǎng)濃度。

圖1 H2O2對(duì)RA-FLS細(xì)胞增殖的影響（n=5）Fig.1 Effect of H2O2 on RA-FLS proliferation（n=5）

3 白藜蘆醇誘導(dǎo)低濃度H2O2處理的RA-FLS凋亡

TUNEL法檢測(cè)不同濃度Res（0、5、20、50、100 μmol/L）對(duì)經(jīng)低濃度（5μmol/L）H2O2處理的RA-FLS凋亡顯示，0μmol/L Res處理未見明顯FRAFLS凋亡現(xiàn)象；隨著Res濃度的升高，F(xiàn)LS凋亡呈增加趨勢(shì)（圖2）。

圖2 白藜蘆醇誘導(dǎo)低濃度H2O2處理的RA-FLS凋亡（TUNEL染色）。A，0μmol/L Res；B，5μmol/L Res；C，20μmol/L Res； D，50μmol/L Res； E，100μmol/L Res；F，200μmol/L Res；比例尺，50μmFig. 2 Resveratrol induces the apoptosis of RA-FLS treated with 5μmol/L H2O2. A, 0μmol/L Res; B, 5μmol/L Res; C, 20μmol/L Res; D, 50μmol/L Res;E, 100μmol/L Res; F, 200μmol/L Res; scale bar, 50μm

4 白藜蘆醇對(duì)自噬蛋白Beclin-1和LC3I/II表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)不同濃度 Res（0、5、20、50μmol/L）對(duì)經(jīng)5μmol/L H2O2處理的RA-FLS自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響顯示，與0μmol/L Res處理的對(duì)照組比較，隨著Res濃度（5、20、50μmol/L）上升，自噬蛋白beclin-1和LC3 I/II的表達(dá)量逐漸降低。

討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中氧化應(yīng)激性反應(yīng)是一個(gè)重要因素，RA患者由于長(zhǎng)期關(guān)節(jié)疼痛、功能受限、治療等，機(jī)體常常處于應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，增加活性氧自由基（ reactive oxygen species，ROS）[5]。生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的濃度高低表示組織細(xì)胞受ROS氧化損傷程度，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPx）是機(jī)體重要的抗ROS損傷酶類，保護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[6]。本研究表明，與正常健康對(duì)照者比較，RA患者存在血清MDA的濃度下降，GSHPx和SOD活性升高現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)RA患者體內(nèi)存在氧化應(yīng)激狀態(tài)。

圖3 白藜蘆醇對(duì)低濃度H2O2處理的RA-FLS內(nèi)Beclin-1和LC3I/II表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of Resveratrol on the expression of Beclin-1 and LC3I/II in RA-FLS treated with 5μmol/L H2O2

RA患者的主要特征為滑膜增厚，其中成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）、炎細(xì)胞（包括淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）形成血管翳，形成滲透物浸潤(rùn)破壞局部的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，F(xiàn)LS在RA發(fā)病過(guò)程中至關(guān)重要[7]。另外炎細(xì)胞和FLS可產(chǎn)生促炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等，刺激活化的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌ROS，損傷關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)[8]。為探討RA患者機(jī)體氧化應(yīng)激對(duì)FLS生長(zhǎng)的影響，我們采用組織塊和膠原酶消化作用，體外培養(yǎng)RA-FLS；然后用CCK-8法，檢測(cè)不同濃度的H2O2對(duì)FLS增殖的影響，研究發(fā)現(xiàn)，低濃度（1～5μmol/L） H2O2可促進(jìn)FLS細(xì)胞增殖，當(dāng)H2O2濃度繼續(xù)升高，F(xiàn)LS增殖活力逐漸下降，故在體外實(shí)驗(yàn)中以H2O2（5μmol/L）作為刺激FLS細(xì)胞生長(zhǎng)濃度。我們前期研究已證實(shí)[3,4]，在RA的常用動(dòng)物模型佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠模型組中存在氧化應(yīng)激，白藜蘆醇（Res）可以降低AA大鼠氧化應(yīng)激。本研究通過(guò)TUNEL法檢測(cè)不同濃度Res對(duì)低濃度H2O2處理RA-FLS細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，RA-FLS凋亡隨著Res濃度的升高而增加。

ROS在誘導(dǎo)細(xì)胞自噬方面起重要作用，通過(guò)氧化調(diào)節(jié)自噬轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)自噬蛋白[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，正常條件下，自噬相關(guān)蛋白beclin-1與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 或Bcl-XL相互結(jié)合，導(dǎo)致beclin-1形成吞噬泡，在LC3 I/II作用下延長(zhǎng)包繞線粒體并發(fā)育成熟，然后與溶酶體結(jié)合，引發(fā)線粒體自噬。為了解Res引起RA-FLS細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們研究了自噬相關(guān)的標(biāo)志物L(fēng)C3 I/II和beclin-1蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示Res處理24h后，隨著Res濃度增加而自噬作用減弱。因此，RA-FLS凋亡可能是由氧化應(yīng)激和自噬通路蛋白表達(dá)下降引起ROS的積累，過(guò)多的ROS引起FLS細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，RA患者機(jī)體存在脂質(zhì)過(guò)氧化，一定范圍的過(guò)氧化會(huì)引起RA-FLS異常增殖，Res對(duì)RAFLS的異常增生的抑制作用，誘導(dǎo)FLS凋亡，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激和自噬通路蛋白表達(dá)下降有關(guān)。

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