卞煒，秦文熠

（1重慶市永川區(qū)中醫(yī)院康復(fù)科 重慶 402160，2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科 重慶 400016)

缺血性腦卒中具有高致死率和致殘率[1]。腦再灌注后炎性反應(yīng)是局灶腦缺血/再灌注眾多復(fù)雜病生理機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]，也是決定卒中預(yù)后的主要因素[3]。研究表明，Nod樣受體蛋白3（NOD-like receptor pyrin 3，NLRP3）炎性小體在腦缺血損傷后炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[4-81]。NLRP3炎性小體的激活有3種模式：ATP-P2X7R受體介導(dǎo)離子通道的開(kāi)放引起胞內(nèi)鉀離子外流、活性氧的誘導(dǎo)和溶酶體破壞引發(fā)組織蛋白酶的釋放，第一種是最主要的激活模式[2-3]。嘌呤受體配體門(mén)控性離子通道7（purinergic 2X7 receptor，P2X7R）是一種配體門(mén)控離子通道，細(xì)胞損傷時(shí)釋放的大量ATP可激活P2X7R[4-56]。研究表明，P2X7R是NLRP3炎性小體激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[7-8]，激活的NLRP3炎性小體可活化caspase-1，促進(jìn)多種細(xì)胞因子如IL-1β和IL-18的成熟和分泌并作用于多種效應(yīng)細(xì)胞[16]。腦缺血/再灌注早期腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)P2X7R/NLRP3信號(hào)途經(jīng)調(diào)控炎癥反應(yīng)[6，17]，大量研究表明，電針治療可減輕腦缺血/再灌注損傷早期炎性反應(yīng)[18-20]。本研究通過(guò)觀察電針對(duì)局灶腦缺血/再灌注大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)P2X7R、NLRP3表達(dá)影響，探討P2X7R、NLRP3在電針調(diào)控局灶腦缺血/再灌注炎性損傷中的可能作用。

材料與方法

1 局灶腦缺血/再灌注模型建立

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重250-300 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（渝）2012-0001）。按隨機(jī)原則將大鼠分為假手術(shù)組（sham組）、模型組（I/R組）、模型+電針組（I/RE組），每組16只，大鼠術(shù)前禁食12h，不禁飲。大鼠采用Longa等[21]改良線栓法規(guī)范化制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。3.5%水合氯醛（1ml/100g）腹腔注射麻醉大鼠，頸部備皮消毒后行頸正中縱行切口，充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），分離頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）顱外段，凝斷甲狀腺動(dòng)脈及交通支動(dòng)脈后，燒斷ECA游離備用，蛙心夾暫時(shí)夾閉ICA，在ECA殘端剪一小口，緩慢插入預(yù)先準(zhǔn)備的頭端圓鈍、直接約0.25～0.27mm的線栓，線栓經(jīng)CCA分叉處進(jìn)入ICA，線栓頭端距離分叉處約18～20mm處感插線栓有明顯阻力，表示線栓頭端已到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始端，停止繼續(xù)推進(jìn)栓子，固定線栓，頸部創(chuàng)口縫合消毒后放置37℃恒溫臺(tái)保溫待醒。栓塞90min后拔出線栓至ECA殘端實(shí)現(xiàn)再灌注。Sham組尼龍線栓插入10mm左右深度進(jìn)入ICA顱外部即可，其余操作同上待大鼠完全清醒后，采用Bederson 5分法[11]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，1-3分者入選實(shí)驗(yàn)。凡因各種原因?qū)е赂鲗?shí)驗(yàn)組動(dòng)物數(shù)不足預(yù)定數(shù)量者，均按照隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

2 電針干預(yù)方法

參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸委員會(huì)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜，對(duì)I/RE組大鼠于再灌注后0、12h、24h行電針治療，選取大鼠“百會(huì)”、左側(cè)“四關(guān)”（“合谷”和“太沖”）為電針穴位，刺激參數(shù)采用頻率為2/100 Hz，波型為疏密波，電流強(qiáng)度為1mA，20min/次。

3 主要試劑和儀器

P2X7R多克隆抗體（CST公司，英國(guó)）、NLRP3多克隆抗體（CST公司，英國(guó)）、Iba-1多克隆抗體（Novus公司，美國(guó)），驢抗山羊熒光二抗-FITC(Proteintech，SA00003-3，1:200)，IL-1β 和 IL-18 ELISA試劑盒（碧云天，中國(guó)），熒光定量PCR相關(guān)試劑（Takara公司，日本），P2X7R和NLRP3引物（上海生物生工有限公司合成），G6850型電針治療儀（購(gòu)自北京精工儀器廠），電泳、電轉(zhuǎn)儀及凝膠成像儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），激光掃描共聚焦顯微鏡（Nikon，東京，日本）。

4 Western blot

取缺血區(qū)大腦皮質(zhì)約100mg加入蛋白裂解液（RIPA:PMSF=100:1），徹底勻漿后靜置30min，4℃10000r/min離心10min，取上清液，即為全蛋白提取物。采用BCA蛋白定量法檢測(cè)所提蛋白濃度。用4×上樣緩沖液將剩余蛋白稀釋成相同濃度，后100℃沸水中煮5min，-80℃保存。以10μg上樣量行SDSPAGE凝膠電泳（10%分離膠，12%濃縮膠），恒壓操作60～100V電泳約2.5h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉90min，孵育一抗（P2X7R、NLRP3抗體稀釋比例為1:1000），4℃過(guò)夜后復(fù)溫2h，TBST洗膜后孵育二抗（稀釋比例為1:2000）2h，TBST洗膜后ECL凝膠成像儀顯影，采用Fusion軟件進(jìn)行光密度分析。

5 熒光定量RT-PCR

再灌注24h后，于冰上迅速切取右側(cè)缺血半暗帶腦組織置于玻璃勻漿器中，用Trizol裂解液，按TAKALA試劑盒說(shuō)明書(shū)提取缺血半暗帶組織內(nèi)總mRNA。取1μl mRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。將含有SyberGreen的TaqMan (10μl體系)進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。按照Pubmed上GenBank提供的序列由TAKALA公司合成引物：NLRP3上游引物5’-GTGTTTCGAAATCCCACTGTG-3’， 下 游 引 物 5’-TCTGCTTCTCACGTATTTCTG-3’，P2X7R 上 游 引 物5’-GAACAATATCACTTCCCCGG-3’， 下 游 引 物5’-TTATCGCCTGTTTCTCGGAAG-3’， GAPDH 上游引物 5’-ATGACATCAAGAGGTGGTG-3’，下游引物5’-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3’。RT-PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變形95℃，變性95℃ 15s，退火/延伸57℃ 1min，40個(gè)循環(huán)。

6 ELISA

于再灌注后24h，采用ELISA試劑盒檢測(cè)缺血側(cè)大腦皮質(zhì)IL-1β和IL-18含量。首先需根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及相應(yīng)OD值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)各樣品的OD值，利用回歸方程計(jì)算出各樣品的濃度。

7 免疫熒光

將大鼠腦組織冰凍切片置于預(yù)冷的丙酮常溫固30min，后用0.1% triton 37℃固定30min，取出PBS沖洗3次，采用5% 驢血清固定37℃封閉1h，甩干血清，滴加Iba-1一抗（稀釋比例為1:200）于4℃過(guò)夜。次日切片37℃復(fù)溫1 h，避光37 ℃孵育FITC標(biāo)記的驢抗山羊熒光二抗1h，后DAPI 37 ℃孵育10min，PBS沖洗3次，50%甘油封片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 電針抑制腦缺血/再灌注神經(jīng)功能損傷

假手術(shù)組大鼠均無(wú)神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)（0分）。再灌注后24h，模型組和電針組大鼠均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損癥狀，且電針組神經(jīng)功能缺損評(píng)分較模型組降低（表1）。

圖1 各組大鼠Bederson神經(jīng)功能評(píng)分的比較。##，與I/R組比較，P＜0.01Fig. 1 Bederson behavior score comparison. ##, P＜0.01, compared with I/R group

2 電針抑制腦缺血/再灌注大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)P2X7R表達(dá)上調(diào)

Western blot檢測(cè)顯示，再灌注后24h，模型組P2X7R蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，電針組P2X7R水平明顯低于模型組（圖2A、B）。RT-qPCR分析顯示，再灌注后24h，模型組P2X7R mRNA較假手術(shù)組明顯升高，電針可明顯降低模型組P2X7R表達(dá)（圖2C）。

3 電針抑制腦缺血/再灌注大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)NLRP3表達(dá)上調(diào)

Western blot檢測(cè)顯示，再灌注后24h，模型組NLRP3蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，電針組NLRP3水平明顯低于模型組（圖3A、B）。RT-qPCR分析顯示，再灌注后24h，模型組NLRP3 mRNA較假手術(shù)組明顯升高，電針可明顯降低模型組NLRP3表達(dá)（圖3C）。

圖2 電針抑制腦缺血/再灌注大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)P2X7R表達(dá)。A，代表性Western blot結(jié)果；B，P2X7R水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C，P2X7R mRNA水平RT-qPCR檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，與sham組比較，0.01＜P＜0.05； ***，與sham組比較，P＜0.001；#，與I/R組比較，0.01＜P＜0.05；##，與I/R組比較，P＜0.01Fig. 2 Effect of electroacupuncture on P2X7R expression in ischemic cerebral cortex of I/R rats. A, representative results of Western blot; B, statistical analysis of P2X7R protein level; C, statistical naalysis of P2X7R mRNA level detected by RT-qPCR; *, 0.01＜P＜0.05; ***, P＜0.001, compared with sham group; #, 0.01＜P＜0.05; ##, P＜0.01, compared with group I/R

圖3 電針抑制腦缺血/再灌注大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)的NLRP3表達(dá)。A，代表性Western blot結(jié)果；B，NLRP3水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C，NLRP3 mRNA水平RT-qPCR檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；**，與sham組比較，P＜0.01；***，與sham組比較，P＜0.001；#，與I/R組比較，0.01＜P＜0.05；##，與I/R組比較，P＜0.01Fig. 3 Effect of electroacupuncture on NLRP3 expression in ischemic cerebral cortex of I/R rats. A, representative results of Western blot; B, statistical analysis for NLRP3 protein level; C, statistical analysis of NLRP3 mRNA level detected by RT-qPCR; **, P＜0.01; ***, P＜0.001, compared with sham group; #, 0.01＜P＜0.05; ##, P＜0.01, compared with group I/R

4 電針抑制腦缺血/再灌注大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)IL-1β和IL-18表達(dá)上調(diào)

ELISA檢測(cè)顯示，再灌注后24h，模型組腦組織中IL-1β和IL-18含量較假手術(shù)組明顯升高，電針組腦組織中IL-1β和IL-18含量明顯低于模型組（圖4）。

圖4 電針減弱腦缺血/再灌注大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)IL-1β和IL-18含量。A，ELISA檢測(cè)的IL-1β表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；B，ELISA檢測(cè)的IL-18表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)分析； ***，與sham組比較，P＜0.001；###，與I/R組比較，P＜0.001Fig. 4 Effect of electroacupuncture on IL-1β and IL-18 levels in ischemic cerebral cortex of I/R rats . A, statistical analysis of IL-1β level detected by ELISA; B, statistical analysis of IL-18 level detected by ELISA; ***, P＜0.001, compared with sham group; ###, P＜0.001, compared with group I/R

9 電針抑制腦缺血/再灌注大鼠大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加

免疫熒光激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組小膠質(zhì)細(xì)胞很少，幾乎都處于靜息分支狀態(tài)；再灌注后24h，模型組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞胞體明顯增大;電針治療可明顯減少激活狀態(tài)的Iba-1免疫反應(yīng)陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞（圖5）。

圖5電針對(duì)腦缺血/再灌注大鼠大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1免疫陽(yáng)性反應(yīng)的熒光檢測(cè)。比例尺，50μmFig. 5 Immuno fl uorescence examination for the effect of electroacupuncture on microglial in ischemic cerebral cortex of I/R rats. Scale bar, 50μm

討 論

缺血性腦卒中是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的腦血管疾病之一，減輕腦缺血/再灌注后的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是治療缺血性腦卒中的重要難題。研究表明，細(xì)胞內(nèi)NOD樣受體在機(jī)體固有免疫及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，NLRP3炎性小體作為一種多蛋白復(fù)合體，是當(dāng)前研究較熱的NOD樣受體家族成員。NLRP3炎性小體由NLRP3、銜接蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）和前體caspase-1組成，激活的caspase-1可裂解IL-1β和IL-18前體，產(chǎn)生成熟的IL-1β和IL-18，從而募集中性粒細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等免疫細(xì)胞，介導(dǎo)組織炎性損傷[12]，參與機(jī)體免疫、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血/再灌注損傷、腦缺血/再灌注損傷、阿爾茲海默病等多個(gè)疾病[24-26]。Fann等[4,7]通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腦缺血/再灌注損傷后，腦內(nèi)NLRP3炎癥小體被激活，促炎因子IL-1β和IL-18等表達(dá)上調(diào)；NLRP3基因敲除小鼠腦內(nèi)caspase-3、IL-1β和IL-18表達(dá)明顯降低，采用Caspase-1抑制劑可阻斷腦內(nèi)神經(jīng)元損傷，提示NLRP3炎癥小體參與了腦缺血/再灌注炎性損傷。Zhang N等[5]研究亦證實(shí)，腦缺血/再灌注損傷后腦內(nèi)NLRP3、ASC和caspase-1表達(dá)上調(diào)，大黃酚治療可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體激活從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。易敏等[27]研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體主要通過(guò)促進(jìn)促炎因子分泌和誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡從而加重腦再灌注損傷。

對(duì)NLRP3小體激活的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，P2X7R是NLRP3炎性小體激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[15,28]。P2X7R作為一種配體門(mén)控離子通道，可感受內(nèi)源性或外源性刺激下細(xì)胞外的高濃度ATP，激活的P2X7R可致細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流增多，從而激活NLRP3炎癥小體。P2X7R在缺血性腦卒中病理發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[29-30]。Arbeloa[29]和Lammer[30]等發(fā)現(xiàn)，阻斷P2X7R作用，可減少腦梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損癥狀。Feng L等[28]研究表明，在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型中，采用SiRNA阻斷P2X7R作用，可通過(guò)削弱NLRP3炎癥小體激活， 減少I(mǎi)L-1β、IL-18和髓過(guò)氧化物酶等分泌發(fā)揮腦保護(hù)作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的免疫細(xì)胞，在腦缺血缺氧損傷后可迅速參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。研究表明，P2X7R/NLRP3途經(jīng)可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。Ye X等[31]發(fā)現(xiàn)，腦出血損傷時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體明顯激活。Yang F等[4]研究表明，NLRP3基因敲除的小鼠，腦內(nèi)激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示NLRP3可介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活。Gustin A等[32]發(fā)現(xiàn)NLRP3小體主要在腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)和發(fā)揮作用，不能調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮作用。Chu K等[33]發(fā)現(xiàn)，抑制P2X7R表達(dá)，可降低NLRP3表達(dá)，提高全腦缺血/再灌注大鼠存活率和學(xué)習(xí)記憶，減少激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞和促炎因子分泌。

大量研究表明，針刺抗炎治療對(duì)臨床更有效地防治腦血管疾病具有重要的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用價(jià)值。研究表明，電針預(yù)處理可減少腦內(nèi)神經(jīng)元NLRP3、caspase-1和IL-1β表達(dá)[34]，也可抑制炎癥小體激活[35]。電針治療對(duì)局灶腦缺血/再灌注大鼠腦內(nèi)P2X7R的影響目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究在探討電針對(duì)P2X7R表達(dá)變化的同時(shí)，將P2X7R、NLRP3同時(shí)進(jìn)行研究，探討電針治療對(duì)P2X7R/NLRP3信號(hào)途經(jīng)的影響。既往研究表明，腦缺血/再灌注早期腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)P2X7R/NLRP3信號(hào)途經(jīng)調(diào)控炎癥反應(yīng)，而缺血再灌注后24小時(shí)，往往是炎癥發(fā)生、小膠質(zhì)細(xì)胞活化的高峰期，故本研究采用24h作為研究的時(shí)間點(diǎn)，探討電針干預(yù)對(duì)腦內(nèi)P2X7R/NLRP3和小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響。

本研究結(jié)果顯示，局灶腦缺血/再灌模損傷后24h，大腦缺血皮質(zhì)區(qū)P2X7R、NLRP3表達(dá)顯著增多，該趨勢(shì)與既往研究一致。而電針治療后，腦內(nèi)P2X7R、NLRP3蛋白和mRNA表達(dá)顯著降低，激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少。雖然前期研究表明，P2X7R/NLRP3參與調(diào)節(jié)腦缺血/再灌注早期小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，但是電針能否通過(guò)P2X7R/NLRP3信號(hào)途經(jīng)減弱小膠質(zhì)細(xì)胞激活，這是我們下一步需要進(jìn)一步探討明確的。

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