王齊，劉梅梅，雷娜，陳曉宇，戴寒晶，楊珺(安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物化學(xué)教研室，合肥 3060; 安徽醫(yī)科大學(xué)組胚教研室，合肥3003）

缺血性卒中約占腦卒中疾病總數(shù)的70%，是由于大腦血供障礙而引發(fā)的缺血、缺氧，導(dǎo)致局限性腦缺血性壞死及軟化的一種疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復(fù)發(fā)率的特征。二苯乙烯苷（tetrahydroxystilbeneglucoside，TSG）是何首烏中特有的水溶性生物活性成分，具有抑制粥樣硬化、防治老年性癡呆、清除自由基抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)腦組織等多種功能[1-5]。但是，TSG 對(duì)沙鼠I/R 后抑制神經(jīng)元凋亡的機(jī)制尚未完全明了。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立沙鼠全腦I/R模型，研究不同低濃度TSG對(duì)神經(jīng)元遲發(fā)性凋亡相關(guān)因子p53、Bcl-2、Bax等表達(dá)的影響，以探討TSG對(duì)于I/R引發(fā)神經(jīng)元凋亡所起干預(yù)作用的可能機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及造模

雄性蒙古沙鼠，體重70～90g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。25℃室溫飼養(yǎng)，自由進(jìn)食攝水，術(shù)前12h不禁水禁食。將42只實(shí)驗(yàn)蒙古沙鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（Sham）、腦I/R模型對(duì)照組（I/R）、TSG小劑量（1.5mg/kg）組（I/R+TSGs）、TSG中劑量（3mg/kg）組（I/R+TSGm）、TSG大劑量（6mg/kg）組（I/R+TSGl）（根據(jù)課題組前期研究確定的劑量），依達(dá)拉奉（edaravone, Eda）（3mg/kg）陽(yáng)性藥對(duì)照組（I/R+Eda）。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前30min，TSG給藥組腹腔注射給藥，兩側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎再灌30min后再給藥一次，連續(xù)6d，每天均給藥一次。Sham組和I/R組均給予等劑量的生理鹽水。第6d，頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)沙鼠，開(kāi)顱取腦，將海馬CA1區(qū)剝離[6]，放入液氮中迅速冷凍后，-80℃保存，用于海馬CA1區(qū)Bcl-2和Bax的含量測(cè)定；腦組織行HE染色觀察形態(tài)學(xué)改變及行免疫組織化學(xué)檢測(cè)p53表達(dá)水平。

2 藥品與試劑

TSG購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，依達(dá)拉奉注射液購(gòu)于吉林省博大制藥有限責(zé)任公司，兔抗p53、兔抗Bcl-2和兔抗Bax抗體購(gòu)于Abcam公司，兔抗GAPDH抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，兔SP免疫組組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于中杉金橋公司，Western blot超敏發(fā)光液購(gòu)于普利萊基因技術(shù)有限公司。

3 SP法免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)p53表達(dá)

各實(shí)驗(yàn)組沙鼠麻醉后，取腦，將各實(shí)驗(yàn)組沙鼠腦組織多聚甲醛溶液固定，常規(guī)乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片厚度5μm，脫臘水化后微波法進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫去離子水孵育消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性，滴加正常山羊血清封閉液后再滴加p53一抗（1:100），4℃過(guò)夜，次日滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育15min后再滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15min后DAB顯色，蘇木精復(fù)染后脫水封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，染成棕色的為陽(yáng)性細(xì)胞。每個(gè)標(biāo)本取3張切片，在光學(xué)顯微鏡（40×物鏡）下觀察，20倍物鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)不重復(fù)視野中染成棕色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，得出其平均數(shù)作為本組代表值。

4 Western blot檢測(cè)Bax和Bcl-2表達(dá)

沙鼠海馬CA1區(qū)組織加入含有RIPA裂解液中裂解后，以轉(zhuǎn)速12000r/min離心10min，提取上清液后測(cè)定樣品蛋白，取蛋白40μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉后分別加入Bax和Bcl-2一抗，4℃過(guò)夜，洗膜后加入二抗室溫孵育1h，超敏發(fā)光液法曝光、X光片顯影。用凝膠圖象處理系統(tǒng)進(jìn)行分析計(jì)算光密度值，以GAPDH作為內(nèi)參。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 TSG減輕腦缺血再灌注損傷

Sham組神經(jīng)元排列整齊，核大，居中，胞膜清晰，細(xì)胞未見(jiàn)病理性改變。與Sham組相比，I/R組腦組織間質(zhì)水腫較為明顯，核固縮深染、神經(jīng)元數(shù)目明顯減少。與I/R組相比，各TSG處理組和陽(yáng)性對(duì)照組神經(jīng)元數(shù)量均有增多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，間質(zhì)水腫減輕（圖1）。

2 TSG降低腦缺血再灌注損傷對(duì)腦組織中p53免疫組織化學(xué)表達(dá)的上調(diào)

免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)顯示，Sham組偶見(jiàn)p53陽(yáng)性細(xì)胞，I/R組可見(jiàn)大量p53陽(yáng)性細(xì)胞，TSG 中、高劑量組及陽(yáng)性藥對(duì)照組的p53陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較I/R組顯著降低，表明TSG可減少I/R 損傷后神經(jīng)元p53免疫組織化學(xué)表達(dá)的上調(diào)，但TSG低劑量組仍可見(jiàn)數(shù)量較多的p53陽(yáng)性細(xì)胞，表明低劑量的TSG對(duì)I/R損傷后神經(jīng)元p53表達(dá)上調(diào)的抑制作用不明顯（圖2）。

3 TSG抑制缺血再灌注損傷對(duì)海馬CA1區(qū)Bax表達(dá)水平的上調(diào)

Western blot檢測(cè)顯示，相比較Sham組，I/R組沙鼠海馬CA1區(qū)組織中Bax水平顯著增高，TSG中、高劑量組和陽(yáng)性藥對(duì)照組均顯著抑制I/R所引發(fā)的Bax水平上調(diào)（圖3）。

圖1 TSG對(duì)沙鼠腦組織I/R損傷影響的HE染色觀察。A，Sham組；B，I/R組；C，I/R +TSGs組；D，I/R+TSGm組；E，I/R +TSGl組；F，I/R+Eda組；比例尺，50μmFig.1 The effect of TSG on the brain tissue of I/R gerbils was evaluated by HE staining. A, sham group; B, I/R group; C, I/R+ TSGs group; D, I/R+TSGm group; E, I/R+TSGl group; F, I/R+ Eda group; scale bar, 50μm

圖2 TSG對(duì)沙鼠I/R損傷后腦組織中p53免疫組織化學(xué)表達(dá)的影響。A，假手術(shù)組；B，I/R模型對(duì)照組；C，I/R模型+TSG小劑量組；D，I/R模型+TSG中劑量組；E，I/R模型+TSG高劑量組；F，I/R模型+陽(yáng)性藥對(duì)照組；比例尺，50μm；G，p53免疫反應(yīng)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，與Sham組比較，P＜0.01；#，與I/R組比較，P＜0.01Fig.2 The effect of TSG on p53 expression in the brain tissue of I/R gerbils was evaluated by immunohistochemistry. A, sham group; B, I/R group; C,I/R+TSGs group; D, I/R+ TSGm group; E, I/R+ TSGl group; F, I/R+ edaravone group; scale bar, 50μm; G, statistical analysis for p53 immunoreactivity;*, P＜0.01 vs Sham group; #, P＜0.01 vs I/R group

圖3 TSG對(duì)沙鼠I/R損傷后海馬Bax表達(dá)的影響。A，代表性Western blot檢測(cè)；B，Bax水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，與Sham組比較，P＜0.01；#，與I/R組比較，P＜0.01Fig.3 Effect of TSG on Bax expression in the hippocampal of I/R gerbils.A, representative images of Western blot; B, statistical analysis for Bax expression. * P＜0.01 vs Sham group; # P＜0.01 vs I/R group

4 TSG抑制缺血再灌注損傷對(duì)海馬CA1區(qū)Bcl-2表達(dá)水平的下調(diào)

Western blot檢測(cè)顯示，I/R組沙鼠海馬CA1區(qū)組織中Bcl-2水平明顯低于Sham組，TSG 中、高劑量組和陽(yáng)性藥對(duì)照組Bcl-2水平顯著高于I/R組（圖4）。

圖4 TSG對(duì)沙鼠I/R損傷后海馬Bcl-2表達(dá)的影響。A，代表性Western blot檢測(cè)；B，Bcl-2水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，與Sham組比較，P＜0.01；#，與I/R組比較，P＜0.01Fig. 4 Effect of TSG on Bcl-2 expression in the hippocampal of I/R gerbils. A, representative images of Western blot; B, statistical analysis for Bcl-2 expression; *, P＜0.01 vs Sham group; #, P＜0.01 vs I/R group

討 論

腦缺血/再灌注損傷的病理生理變化是一個(gè)涉及多方面因素的復(fù)雜過(guò)程，如產(chǎn)生了大量的氧自由基、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、細(xì)胞能量障礙、興奮性氨基酸釋放增加等［7］，通過(guò)啟動(dòng)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)并誘導(dǎo)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡或壞死［8］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，TSG對(duì)腦缺血/再灌注引發(fā)的腦損傷，尤其是海馬區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性凋亡，具有顯著的治療作用，而這種治療作用與其抑制caspase-3蛋白的表達(dá)相關(guān)［4］,而TSG對(duì)I/R引發(fā)腦神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用是否還有其他可能的機(jī)制鮮有報(bào)道。細(xì)胞凋亡的相關(guān)調(diào)控基因研究表明，抑制與促進(jìn)細(xì)胞凋亡最重要的兩個(gè)基因是Bcl-2和p53[9]，而B(niǎo)cl-2與Bcl-2家族成員Bax關(guān)系密切，Bax和Bcl-2的比率可能決定細(xì)胞生死趨勢(shì)，另外Bax也是受P53調(diào)控的下游基因。因此，探討p53、Bcl-2與Bax基因在腦缺血性損傷神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)是神經(jīng)細(xì)胞死亡調(diào)控機(jī)制過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，有助于神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)措施的研究。

在發(fā)生缺血性腦損傷時(shí)，被激活的核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）可上調(diào)多種促凋亡基因，從而加速神經(jīng)元凋亡［10］，p53是其調(diào)控的凋亡蛋白中的重要成員之一[11]，在神經(jīng)元凋亡過(guò)程中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用。敲除p53或特異性抑制p53的小鼠在缺血性腦損傷時(shí)引發(fā)的神經(jīng)元凋亡明顯減少，有效減輕缺血性腦組織損傷[12]。Park等［13］研究發(fā)現(xiàn)局灶性缺血性腦損傷前1d給予基因調(diào)節(jié)劑（氧化偶氮甲烷）可明顯減少腦梗死的體積，可能是因?yàn)檠趸嫉淄橐种屏藀53的活化，從而減輕缺血性腦損傷半暗區(qū)神經(jīng)元的凋亡。Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，其高表達(dá)可阻止多種凋亡因素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)ax具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力，故Bcl-2和Bax對(duì)于細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要作用[14-17]。以往研究表明，p53從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體誘導(dǎo)線粒體細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase-9引起細(xì)胞凋亡[18]，p53能上調(diào)Bax并下調(diào)Bcl-2[19]，而腦缺血組織中Bcl-2的表達(dá)升高可以調(diào)節(jié)線粒體膜上鈣離子的內(nèi)流，維持線粒體膜的完整性及調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而改善細(xì)胞凋亡。李楊等[20]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素干預(yù)后，可升高新生大鼠缺血缺氧損傷后海馬的Bcl-2表達(dá)水平，降低Bax表達(dá)水平，從而抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。Amemiya Sliw等[21]發(fā)現(xiàn)腦缺血時(shí)自由基清除藥可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的抗調(diào)亡機(jī)制來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，I/R組腦組織p53蛋白表達(dá)明顯增加，而TSG 中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組的p53蛋白表達(dá)較I/R組顯著減弱； I/R組海馬CA1區(qū)Bax蛋白顯著活化，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)顯著降低，TSG中、高（3、6mg/kg）劑量組均可以顯著誘導(dǎo)Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax的活化。我們推測(cè)TSG可能通過(guò)抑制p53來(lái)上調(diào)Bcl-2下調(diào)Bax,以調(diào)節(jié)線粒體膜上鈣離子的內(nèi)流，維持線粒體膜的完整性及調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而改善神經(jīng)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TSG可對(duì)于腦缺血/再灌注引發(fā)腦神經(jīng)元損傷有明顯的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立沙鼠全腦缺血/再灌注模型，探討TSG對(duì)缺血性腦神經(jīng)元凋亡干預(yù)作用部分可能的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其作用機(jī)制可能與影響凋亡相關(guān)因子（p53、Bcl-2、Bax）的表達(dá)有關(guān)。

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