張潔，張濤，廖宇峰，王揚(yáng)淦，萬(wàn)靜*

（1武漢大學(xué)中南醫(yī)院心內(nèi)科，武漢430000；2武漢科技大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430065；3湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院心內(nèi)科，十堰 442000）

花生四烯酸（arachidonic acid，AA）是一種生物體內(nèi)含量非常豐富的多不飽和脂肪酸，廣泛分布于多個(gè)組織器官中[1]?；ㄉ南┧嶂饕ㄟ^(guò)環(huán)氧化酶（COX）、脂氧化酶（LOX）和細(xì)胞色素P450表氧化酶（cytochrome P450）代謝，其中經(jīng)細(xì)胞色素P450表氧化酶途徑可代謝生成包括5, 6-EET、 8,9-EET、11,12-EET和14, 15-EET在內(nèi)的4種不同類型的環(huán)氧二十碳三烯酸[2]。EETs可通過(guò)細(xì)胞膜分泌到細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)作用，或由可溶性表氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase, sEH）代謝為生物活性明顯減弱的二羥基-二十碳三烯酸（dihydrox-yeicosatrienoic acids，DHETs）[3]。研究表明，在心血管系統(tǒng)中，EETs可舒張冠狀動(dòng)脈，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制炎性反應(yīng)。14, 15-環(huán)氧二十碳-5(Z)-烯酸（14, 15-epoxyeicosa-5(Z)-enoic acid，14, 15-EEZE）是14, 15-EET的結(jié)構(gòu)類似物，也是EETs的選擇性拮抗劑，可抑制EETs在心血管系統(tǒng)中的多種保護(hù)作用[4]。14, 15-EET已被證實(shí)有抗心肌細(xì)胞凋亡作用，但是加用其抑制劑14, 15-EEZE后對(duì)心肌細(xì)胞的作用仍有待研究。細(xì)胞磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3–kinase/AKT）信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，已有研究表明該通路在14, 15-EET對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用的機(jī)制中扮演重要角色。FoxO1是FoxO家族中的亞族，同樣在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及凋亡中發(fā)揮重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選用14, 15-EET及其抑制劑14, 15-EEZE，觀察兩者對(duì)棕櫚酸（palmitate acid，PA）誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)對(duì)細(xì)胞AKT和Fox01磷酸化表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步研究 14, 15-EET及其抑制劑14, 15-EEZE在心肌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制提供線索。

材料與方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

H9c2細(xì)胞株由武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心提供，用含15%胎牛血清的高糖DMEM靜置孵育在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合度時(shí)，0.25%胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為以下5組：

①陰性對(duì)照組（Vehicle）：用溶媒處理；②PA對(duì)照組（Control）：僅用0.25mmol/L PA（上海阿拉丁生化科技股份公司）處理；③EET組：用200 nmol/L的14, 15-EET（Cayman，美國(guó)）處理；④EEZE組：以5.0μmol/L的 14, 15-EEZE（Cayman，美國(guó)）處理；⑤EET+EEZE組：200 nmol/L的14, 15-EET與5.0μmol/L的14, 15-EEZE聯(lián)合處理細(xì)胞。

2 MTT細(xì)胞抑制率檢測(cè)

5組不同干預(yù)因素處理的H9c2心肌細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)24h，并于結(jié)束前4h在96孔培養(yǎng)板每孔中加入20μl 濃度為5mg/ml的MTT（AMRESCO，美國(guó)）固定液，除去上清液，再在每孔中加入150μl二甲基亞砜混合均勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)各個(gè)孔中細(xì)胞在570nm的光吸收值。

各組細(xì)胞的增殖抑制率（%）=（1-單一或聯(lián)合給藥組OD值/空白對(duì)照組OD值）×100%。

3 流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

5組不同干預(yù)因素處理的H9c2心肌細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)24h，0.25%胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞消化液，離心機(jī)1500r/min離心5min，除去上清液，預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，重懸液離心機(jī)1500r/min離心5min，除去上清液，300μl的Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加入5μl Annexin V-FITC和5μl propidium iodide(PI)混和均勻，常溫避光共同作用15min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

4 免疫印跡法檢測(cè)p-AKT和p-FoxO1表達(dá)水平

5組不同干預(yù)因素處理的H9c2心肌細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)24h，吸出培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS沖洗后加入細(xì)胞裂解液，充分作用后用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，放入離心管中冰浴30min，離心機(jī)12000r/min離心5min，收集上清，移入新的離心管，-20℃冰箱中保存蛋白。實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇BCA法檢測(cè)蛋白濃度。提取蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，室溫下用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1h，分別加入1:500稀釋的一抗（兔抗人p-AKT、AKT、p-FoxO1、FoxO1，Santa Cruze，美國(guó)），4℃孵育過(guò)夜，TBST室溫下洗膜3次，每次5min，后加入1:3000稀釋的二抗（Santa Cruz），室溫下孵育30min，TBST洗膜三次，每次5min，暗室中ECL液顯色曝光。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 14, 15-EET和14, 15-EEZE分別抑制和促進(jìn)對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞增殖抑制

14, 15-EET和14, 15-EEZE單獨(dú)或共同作用于PA預(yù)處理的H9c2細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞MTT法檢測(cè)增殖，各組細(xì)胞的增殖抑制率（%）=（1-單一或聯(lián)合給藥組OD值/空白對(duì)照組OD值）×100%。結(jié)果提示，相對(duì)于陰性對(duì)照組，對(duì)照組H9c2細(xì)胞增殖抑制率明顯上升，表明PA可明顯抑制H9c2細(xì)胞增殖能力；相對(duì)于單純PA處理組，EET組H9c2細(xì)胞的增殖抑制率明顯下降，表明14, 15-EET可削弱PA對(duì)H9c2細(xì)胞增殖的抑制作用；EEZE組H9c2細(xì)胞的增殖抑制率明顯上升，表明14, 15-EEZE可增強(qiáng)PA對(duì)H9c2細(xì)胞增殖的抑制作用；相對(duì)于EET組，EET+EEZE組H9c2細(xì)胞增殖抑制率明顯上升，表明14, 15-EEZE可削弱14, 15-EET削弱PA對(duì)H9c2細(xì)胞增殖抑制的能力（表1）。

表1 14, 15-EET和14, 15-EEZE對(duì)PA預(yù)處理H9c2細(xì)胞抑制率的影響Tab.1 The inhibitory effects of 14, 15-EET and 14, 15-EEZE on the proliferation rate of PA pretreated H9c2 cells

2 14, 15-EET和14, 15-EEZE分別抑制和促進(jìn)棕櫚酸誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡

14, 15-EET和14, 15-EEZE單獨(dú)或共同作用于PA預(yù)處理H9c2細(xì)胞后24h，收集細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡的比例為（7.23±0.46）%，對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡的比例為（41.03±1.57）%、EET組為（18.02±1.18）%，EEZE組為（49.32±1.63）%，EET+EEZE組為（39.79±1.11）%（圖1）。與陰性對(duì)照組比較，對(duì)照組凋亡心肌細(xì)胞比例明顯升高，提示PA有明確的致H9c2細(xì)胞凋亡作用；相對(duì)于對(duì)照組，EET組心肌細(xì)胞的凋亡比例顯著下降，提示14, 15-EET可以抑制PA的致H9c2心肌細(xì)胞凋亡作用；而EEZE組心肌細(xì)胞的凋亡比例顯著上升，提示14, 15-EEZE可以強(qiáng)化PA的致H9c2心肌細(xì)胞凋亡作用；相對(duì)于EET組，EET+EEZE組心肌細(xì)胞凋亡比例明顯上升，提示14, 15-EEZE可以削弱14, 15-EET對(duì)PA致H9c2心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用。

圖1 14, 15-EET和14, 15-EEZE對(duì)PA預(yù)處理H9c2細(xì)胞凋亡影響的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析。A，Vehicle組；B，Control組；C，EET組；D，EEZE組；E，EET+EEZE組；F，細(xì)胞凋亡率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 #，與陰性對(duì)照組比較，P＜0.01；*，與對(duì)照組比較，P＜0.01；&，與EET組比較，P＜0.01；n=4Fig. 1 The effects of 14, 15-EET and 14, 15-EEZE on the apoptosis rate of PA pretreated H9c2 cells evaluated by flow cytometry. A, vehicle group; B,control group; C, EET group; D, EEZE group; E, EET+EEZE group; F, statistical analysis of apoptotic rates; #, P＜0.01, compared with vehicle group;*, P＜0.01, compared with control group; &, P＜0.01, compared with EET group; n=4

3 14, 15-EET和14, 15-EEZE分別抑制和促進(jìn)棕櫚酸對(duì)H9c2細(xì)胞p-AKT和p-FoxO1水平的降低

14, 15-EET和14, 15-EEZE單獨(dú)或共同作用于PA預(yù)處理H9c2細(xì)胞后24h后收集細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，Western blot檢測(cè)p-AKT和p-FoxO1水平的變化。結(jié)果顯示（圖2），與陰性對(duì)照組相比，對(duì)照組心肌細(xì)胞p-AKT和p-FoxO1水平明顯下降，提示PA的作用可明顯降低H9c2細(xì)胞p-AKT和p-FoxO1水平。相對(duì)于對(duì)照組，EET組p-AKT和p-FoxO1水平顯著增加，而EEZE組p-AKT和p-FoxO1水平顯著減少，提示14, 15-EET可通過(guò)增加p-AKT和p-FoxO1水平的方式發(fā)揮抗PA誘導(dǎo)凋亡的作用，14, 15-EEZE則可通過(guò)減少p-AKT和p-FoxO1表達(dá)水平的方式發(fā)揮促PA誘導(dǎo)凋亡的作用。相對(duì)于EET組，EET+EEZE組心肌細(xì)胞中p-AKT和p-FoxO1表達(dá)水平的作用明顯減弱，提示14, 15-EEZE削弱14, 15-EET的抗PA誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡作用與減弱14, 15-EET增強(qiáng)心肌細(xì)胞p-AKT和p-FoxO1表達(dá)水平的作用密切相關(guān)。

圖2 Western blot檢測(cè)14, 15-EET和14, 15-EEZE對(duì)PA預(yù)處理H9c2細(xì)胞p-AKT和p-FoxO水平的影響。A，代表性Western blot檢測(cè)結(jié)果；B，p-AKT和p-FoxO1水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；#，與陰性對(duì)照組比較，P＜0.01；*，與對(duì)照組比較，P＜0.01；&，與EET組比較，P＜0.01；n=4 Fig. 2 The effects of 14, 15-EET and 14, 15-EEZE on p-AKT and p-FoxO1 levels in PA pretreated H9c2 cells detected by Western blot. A, representative Western blot; B, statistical analysis for p-AKT and p-FoxO1 levels; #, P＜0.01, compared with vehicle group; *, P＜0.01, compared with control group;&, P＜0.01, compared with EET group; n=4

討 論

心血管系統(tǒng)疾病是全球范圍內(nèi)死亡率第一的疾病，其發(fā)生發(fā)展與心肌細(xì)胞的壞死和凋亡密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡存在于心臟疾病發(fā)生發(fā)展的一系列病理生理過(guò)程中，是諸多心臟疾病發(fā)生的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[5]。飽和脂肪酸正常情況下是成人心臟能量的主要來(lái)源，糖尿病、肥胖和高脂血癥患者脂肪酸水平長(zhǎng)期紊亂，造成心肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常蓄積，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[6]。有研究顯示，棕櫚酸作為人體內(nèi)含量最豐富的飽和脂肪酸，可誘導(dǎo)包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡[7]。

EETs在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，研究證實(shí)EETs可通過(guò)活化PI3K/ AKT信號(hào)通路，增加抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)，抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；EETs還可通過(guò)降低ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，增強(qiáng)PPARγ活性，抑制NF-κB的活化和轉(zhuǎn)位，減少IκB的磷酸化等一系列機(jī)制發(fā)揮抗炎作用[8]。EETs在糖脂代謝的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用，可增強(qiáng)2型糖尿病大鼠腎臟組織對(duì)胰島素的敏感性，延緩糖尿病腎病的發(fā)展[9]；CYP2J2基因過(guò)表達(dá)EETs產(chǎn)量增加，可以通過(guò)抑制脂毒性相關(guān)的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變性[10]。本實(shí)驗(yàn)選擇14, 15-EET單獨(dú)或加用EETs化學(xué)合成拮抗劑14, 15-EEZE作用于PA誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞，觀察到14, 15-EEZE可明顯削弱14, 15-EET的抗心肌細(xì)胞凋亡作用。除此之外，還有研究證實(shí)14, 15-EEZE可抑制EETs的血管舒張和縮小梗死心肌面積的作用，說(shuō)明14, 15-EEZE可針對(duì)EETs在心血管系統(tǒng)中的保護(hù)作用發(fā)揮一系列阻斷效應(yīng)[4]。14, 15-EEZE無(wú)法通過(guò)減少EETs的合成發(fā)揮作用，其作用機(jī)制很可能與EETs競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞膜內(nèi)外特定結(jié)合位點(diǎn)或受體有關(guān)[11]，針對(duì)EETs和14,15-EEZE相互作用的具體結(jié)合位點(diǎn)的研究目前仍在進(jìn)行之中。

為了進(jìn)一步探討14, 15-EET抗心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選用14, 15-EET作用于PA誘導(dǎo)凋亡的H9c2細(xì)胞，結(jié)果提示PA作用后H9c2細(xì)胞p-AKT蛋白表達(dá)明顯減少，加入14, 15-EET后p-AKT蛋白表達(dá)明顯上升，而之后14, 15-EEZE抑制劑的作用可明顯減少p-AKT蛋白表達(dá)；14, 15-EEZE直接作用于PA預(yù)處理的細(xì)胞可在PA作用的基礎(chǔ)上進(jìn)一步減少p-AKT蛋白的表達(dá)。以上研究提示14, 15-EET對(duì)PA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用與AKT信號(hào)通路的活化密切相關(guān)。FoxO轉(zhuǎn)錄因子家族在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中扮演重要角色，其亞家族FoxO1在心肌細(xì)胞的存活和代謝中發(fā)揮重要作用[12,13]。AKT信號(hào)通路與FoxO蛋白活化密切相關(guān)，在AKT信號(hào)通路

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綜上所述，14, 15-EET可通過(guò)AKT/FoxO1信號(hào)通路發(fā)揮抑制PA誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡作用，14, 15-EEZE也可通過(guò)此通路發(fā)揮對(duì)14, 15-EET對(duì)PA誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的抑制作用，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究和闡明。in MC3T3-E1 cell by activation of nuclear factor-kappa B.Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 2014, 94(14): 1101-1104.

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