曹碗君，趙潔，喬慧蓮，馬斌芳，李臻

（第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，西安 710032）

組蛋白甲基化是指發(fā)生在H3和H4組蛋白N端賴(lài)氨酸(lysine) (K)或者精氨酸殘基上的甲基化，其中H3K4的甲基化與基因的激活相關(guān)，由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)催化。人類(lèi)組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶由以下3對(duì)復(fù)合物組成：SETd1A/SETd1B、MLL1/2和MLL3/4[1]。PTIP相關(guān)蛋白1（PTIP associated protein 1，PA1)首次由Young-Wook Cho等在研究MLL3/4復(fù)合體功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，因?yàn)楹蚉ax轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白（Pax transactivation-domain interacting protein，PTIP）關(guān)系密切，同為MLL3/4復(fù)合體內(nèi)重要組成部分而得名；他們通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PTIP和PA1只存在于MLL3/4復(fù)合體中[2]。人類(lèi)PA1蛋白包含254個(gè)氨基酸，而小鼠PA1則由253個(gè)氨基酸序列構(gòu)成，兩者在氨基酸水平有87%序列一致。Jing Liang等采取Northern blot方法，對(duì)人心臟、腦、胎盤(pán)、肺、骨骼肌、肝臟和胰腺等器官進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些器官中均存在PA1，說(shuō)明PA1廣泛表達(dá)在人體的各個(gè)器官[3]。然而，PA1在雄性生殖系統(tǒng)中的表達(dá)及其功能尚無(wú)報(bào)道。本文采用PCR、免疫組織化學(xué)染色以及熒光雙標(biāo)技術(shù)，檢測(cè)PA1在小鼠睪丸發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)及定位，為以后進(jìn)一步深入探究其在雄性生殖系統(tǒng)中的功能及作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

材料與方法

1 組織材料

SPF級(jí)C57小鼠，出生后 1w、2w、4w、8w、12w、18w及24w各4只，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2%苯戊巴比妥以45 mg/kg體重腹腔麻醉，取左側(cè)睪丸用于提取RNA進(jìn)行PCR分析，右側(cè)睪丸取出后立即置于4%多聚甲醛中固定24h，石蠟包埋，切片（5μm）用于免疫組織化學(xué)染色。

2 主要試劑

RNA提取液Trizol plus，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit, Premix Taq以及SYBR Primix Ex Taq均購(gòu)自日本Takara公司。檸檬酸鹽抗原修復(fù)液購(gòu)自西安科昊生物有限公司。兔抗小鼠PA1多克隆抗體（NBP1 89792）購(gòu)自美國(guó)NOVUS公司，生物素標(biāo)記的抗兔IgG、 SABC檢測(cè)試劑盒（SP-9000）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。小鼠抗小鼠Sox-9單克隆抗體（SC-166505）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，小鼠抗小鼠AMHR2單克隆抗體(ab-64762)購(gòu)自Abcam公司，Alexa Fluor 594標(biāo)記抗兔IgG，Alexa Fluor 488標(biāo)記抗小鼠IgG均購(gòu)自美國(guó)Molecular Probe公司。

3 RT-PCR

新鮮睪丸組織100mg，剪碎研磨用Trizol法提取總RNA，在20μL 體系中加入1μg RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以37℃ 15min、 85℃ 5s反應(yīng)條件合成cDNA第一鏈，以新合成的cDNA為模板進(jìn)PCR，擴(kuò)增PA1基因，PA1上游引物為：5’-TGG CCC AAA CCT AAA CAT TAG-3’；下游引物為：5’-TTA TGG CGC TTC ATG TCT GAG-3’，預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為200bp，25μL的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃60s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。為了檢測(cè)各RNA樣品完整性和反轉(zhuǎn)錄效率之間的差別，將待測(cè)樣品中的β-actin基因設(shè)為內(nèi)參照。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

4 實(shí)時(shí)定量PCR

以cDNA為模板用SYBR Premix Ex Taq 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，反應(yīng)條件為95℃ 30s；95℃ 30s，60℃ 30s，40個(gè)循環(huán)。具體操作均按Takara說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每次擴(kuò)增均設(shè)目的基因組和內(nèi)參基因組及空白對(duì)照組，通過(guò)對(duì)每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（即CT值），按指數(shù)擴(kuò)增的規(guī)律計(jì)算出組織中PA1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

5 ABC法免疫組織化學(xué)染色

切片常規(guī)脫蠟至水后檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）微波修復(fù)（100°C 10min），0.3%甲醇-H2O2中室溫1h，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；加一抗（兔抗PA1，1:200）4℃孵育過(guò)夜，生物素標(biāo)記二抗（抗兔IgG，1:400）室溫孵育3h，ABC復(fù)合物（1:400）室溫孵育1h， 鏡下掌握DAB 呈色，隨后脫水、透明、封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

6 免疫熒光雙標(biāo)染色

切片常規(guī)脫蠟至水后檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）微波修復(fù)（100℃ 10min），1%BSA封閉1h；兔抗PA1（1:200）與小鼠抗Sox-9（1：400）混合一抗，4℃孵育過(guò)夜，Alexa Fluor594標(biāo)記抗兔IgG（1:400）與Alexa Fluor488標(biāo)記抗小鼠IgG（1:400）混合二抗室溫孵育3h，50%甘油封片。用一抗稀釋液代替一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié) 果

1 PA1 mRNA在小鼠睪丸各個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)

對(duì)各周齡小鼠睪丸提取的mRNA進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果顯示在小鼠睪丸發(fā)育不同階段均有PA1 mRNA的表達(dá)，且條帶大小與設(shè)計(jì)方案一致（圖1）。PA1 mRNA在1w小鼠睪丸中的表達(dá)水平較高，在2w時(shí)達(dá)到高峰，隨后（4w）逐漸降低，待8w后維持在穩(wěn)定水平（圖2）。

圖1 PA1 mRNA在小鼠睪丸各個(gè)發(fā)育階段表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)Fig. 1 RT-PCR detection for PA1 mRNA expression in various developmental stages of mouse testis

圖2 PA1 mRNA在小鼠睪丸不同發(fā)育階段表達(dá)變化的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Fig. 2 Quantitative analysis of PA1 mRNA expression during mouse testis development measured by qRT- PCR

2 PA1蛋白在不同發(fā)育階段小鼠睪丸組織中的定位

為進(jìn)一步了解PA1在不同發(fā)育階段小鼠睪丸組織中的定位，我們利用免疫組織化學(xué)法染色觀察了PA1在不同周齡小鼠睪丸的表達(dá)。PA1在1w、2w、4w、8w小鼠生精小管中的精原細(xì)胞和支持細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞核中。在4w和8w小鼠睪丸組織內(nèi)，除了精原細(xì)胞、支持細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞外，PA1還表達(dá)于初級(jí)精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞的胞核，此外在精子頭部也有表達(dá)（圖2）。免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)顯示，紅色熒光信號(hào)標(biāo)記的PA1與綠色熒光信號(hào)標(biāo)記的支持細(xì)胞標(biāo)志物 Sox-9以及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物AMHR2共存，進(jìn)一步證實(shí)PA1在支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中有表達(dá)（圖4）。

圖3 小鼠不同發(fā)育階段睪丸組織PA1表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色。：間質(zhì)細(xì)胞；：支持細(xì)胞；：精原細(xì)胞；:初級(jí)精母細(xì)胞；：圓形精子細(xì)胞；精子；比例尺：50 μmFig. 3 Immunohistochemical detection of PA1 expression in various developmental stages of mouse testes.: Leydig cell;: Sertoli cell;: spermatogonia;: primary spermatocyte.: round spermatid;: sperm; scale bar: 50 μm

圖4 PA1在8w小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞中表達(dá)免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)。比例尺：20 μmFig. 4 Double immuno fl uorescence staining detection of PA1 expression (red) in Sertoli cells (top, cell marker Sox-9 in green) and Leydig cells (bottom,cell marker AMHR2 in green) in 8w mouse testis. Scale bar, 20 μm

討 論

哺乳動(dòng)物生精細(xì)胞的分化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，從精原細(xì)胞開(kāi)始分化到精子的形成涉及許多復(fù)雜的分子機(jī)制，其中包括DNA損傷、修復(fù)及重組，組蛋白的甲基化、磷酸化修飾以及染色質(zhì)的濃縮[4]。研究發(fā)現(xiàn)，PTIP敲除小鼠由于組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶活性減弱，小鼠睪丸發(fā)生萎縮，各級(jí)生精細(xì)胞發(fā)育停滯[5]，提示H3K4甲基化與生精細(xì)胞的生長(zhǎng)分化有關(guān)。PA1和PTIP同為MLL3/4復(fù)合體的核心組件，同時(shí)PA1也被認(rèn)為參與完成組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移功能[2]，因此我們對(duì)PA1在睪丸發(fā)育中的表達(dá)及定位進(jìn)行研究，為進(jìn)一步探究其在生精細(xì)胞生長(zhǎng)分化中的功能及作用打下基礎(chǔ)。

小鼠出生2w后睪丸中精原細(xì)胞開(kāi)始分化，此時(shí)小鼠體內(nèi)的雄激素分泌水平亦達(dá)到高峰，5w時(shí)睪丸開(kāi)始產(chǎn)生成熟精子，8w時(shí)達(dá)到性成熟[6]。我們通過(guò)RT-PCR和定量PCR檢測(cè)到PA1 mRNA在小鼠睪丸各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)，在2w時(shí)表達(dá)最高，隨后降低，8w后維持在一個(gè)穩(wěn)定水平，表明PA1可能通過(guò)調(diào)節(jié)雄激素的分泌，參與生精細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。已知睪丸間質(zhì)細(xì)胞是產(chǎn)生雄激素的場(chǎng)所，免疫組織化學(xué)染色顯示PA1在小鼠各個(gè)發(fā)育階段的間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明PA1參與調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞分泌雄激素。

間質(zhì)細(xì)胞分泌雄激素還受支持細(xì)胞的調(diào)節(jié)，本研究發(fā)現(xiàn)PA1在睪丸各個(gè)發(fā)育階段支持細(xì)胞中均有表達(dá)。支持細(xì)胞可通過(guò)雄激素受體(androgen receptor, AR)影響自身內(nèi)部的抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)分泌，從而間接調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞分泌雄激素[7]，而PA1可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制AR的轉(zhuǎn)錄活性[8]。因此我們推測(cè)PA1在支持細(xì)胞中可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制AR的轉(zhuǎn)錄活性間接調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞分泌雄激素，從而維持生精小管內(nèi)外雄激素的平衡，保證生精細(xì)胞的正常分化。另有研究發(fā)現(xiàn)，支持細(xì)胞可通過(guò)分泌骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein 2, BMP2）對(duì)精原細(xì)胞的分化進(jìn)行調(diào)控[10]，Rossella Puslisi等人在體外培養(yǎng)的小鼠睪丸碎片中添加BMP2后發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞增殖能力顯著提高，表明BMP2對(duì)精原細(xì)胞的增殖有積極作用[11]；此外在PA1敲除的胚胎中BMP2的表達(dá)顯著降低[9]。這些研究說(shuō)明PA1可能作為上游分子參與BMP2對(duì)生精細(xì)胞的增殖分化的調(diào)控。因此我們推測(cè)PA1在支持細(xì)胞中的表達(dá)還可能通過(guò)調(diào)節(jié)BMP2的分泌，從而間接影響精原細(xì)胞的分化。

我們通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察到PA1在小鼠睪丸各個(gè)發(fā)育階段生精細(xì)胞均有表達(dá)，提示PA1作為MLL3/4復(fù)合體的構(gòu)成元件參與調(diào)節(jié)組蛋白H3K4甲基化，從而調(diào)節(jié)精原細(xì)胞向精子分化。睪丸中生精細(xì)胞對(duì)電離輻射刺激相當(dāng)敏感[12]，5Gy的γ射線全身照射后3天，小鼠生精細(xì)胞死亡殆盡[13]。電離輻射可導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，Gong等人發(fā)現(xiàn)293T細(xì)胞中PA1的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)電離輻射敏感性增強(qiáng)，表明PA1在調(diào)節(jié)細(xì)胞DNA損傷后的修復(fù)中亦發(fā)揮著重要作用[14]。因此PA1在睪丸中的表達(dá)可能還參與細(xì)胞DNA的損傷修復(fù)。同時(shí)，Takeshita等的研究發(fā)現(xiàn)PA1表達(dá)升高的乳腺癌患者預(yù)后較好，表明PA1還可能和腫瘤的預(yù)后相關(guān)[15]。然而PA1和生殖系統(tǒng)腫瘤的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述， PA1在睪丸各個(gè)發(fā)育階段的廣泛表達(dá)提示PA1可能通過(guò)調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞分泌雄激素，在支持細(xì)胞作用下維持生精小管中雄激素的平衡，另外通過(guò)BMP2調(diào)節(jié)生精細(xì)胞的生殖和分化，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1] Mohan M, Herz HM, Smith ER, et al. The COMPASS family of H3K4 methylases in Drosophila. Mol Cell Biol, 2011,31(21): 4310-4318.

[2] Cho YW, Hong T, Hong S, et al. PTIP associates with MLL3-and MLL4-containing histone h3 lysine 4 methyltransferase complex. J Biol Chem, 2007, 282(28): 20395-20406.

[3] Liang J, Zhang H, Zhang Y, et al. GAS, a new glutamate-rich protein, interacts differentially with SRCs and is involved in oestrogen receptor function. Embo Rep, 2009, 10(1): 51-57.

[4] Sasaki H, Matsui Y. Epigenetic events in mammalian germcell development: Reprogramming and beyond. Nat Rev Genet, 2008, 9(2): 129-140.

[5] Schwab KR, Smith GD, Dressler GR. Arrested spermatogenesis and evidence for DNA damage in PTIP mutant testes. Dev Biol, 2013, 373(1): 64-71.

[6] Hai Y, Hou J, Liu Y, et al. The roles and regulation of Sertoli cells in fate determinations of spermatogonial stem cells and spermatogenesis. Semin Cell Dev Biol, 2014, 29: 66-75.

[7] Chang C, Chen YT, Yeh SD, et al. Infertility with defective spermatogenesis and hypotestosteronemia in male mice lacking the androgen receptor in Sertoli cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(18): 6876-6881.

[8] Zhang Z, Sun Y, Cho YW, et al. PA1 protein, a new competitive decelerator acting at more than one step to impede glucocorticoid receptor-mediated transactivation. J Biol Chem,2013, 288(1): 42-58.

[9] Kumar A, Lualdi M, Loncarek J, et al. Loss of function of mouse Pax-Interacting Protein 1-associated glutamate rich protein 1a (Pagr1a) leads to reduced Bmp2 expression and defects in chorion and amnion development. Dev Dynam,2014, 243(7): 937-947.

[10] Puglisi R, Montanari M, Chiarella P, et al. Regulatory role of BMP2 and BMP7 in spermatogonia and Sertoli cell proliferation in the immature mouse. Eur J Endocrinol, 2004,151(4): 511-520.

[11] Itman C, Wong C, Whiley PAF, et al. TGFβ superfamily signalling regulators are differentially expressed in the developing and adult mouse testis. Spermatogenesis, 2011,1(1): 63-72.

[12] Hou W, Zhao J, Li Z, et al. Effects of electromagnetic pulse irradiation on the mouse blood-testicle barrier. Urology,2012, 80(1): 221-225.

[13] Khan S, Adhikari JS, Rizvi MA, et al. Radioprotective potential of melatonin against ??Co γ-ray-induced testicular injury in male C57BL/6 mice. J Biomed Sci, 2015, 22: 61.

[14] Gong Z, Cho YW, Kim JE, et al. Accumulation of pax2 transactivation domain interaction protein (PTIP) at sites of DNA breaks via RNF8-dependent pathway is required for cell survival after DNA damage. J Biol Chem, 2009,284(11): 7284-7293.

[15] Takeshita T, Yamamoto-Ibusuki M, Yamamoto Y, et al. PTIP Associated protein 1, PA1, is an independent prognostic factor for lymph node negative breast cancer. PLoS One, 2013,8(11): e80552.