楊 振 董昌海 李 琛 馬玉峰，2 倪 杰 王鉅華 金文杰 錢 鐘*

（1.揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司，江蘇揚(yáng)州 225008；2.金宇生物技術(shù)股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010030；3.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

禽腺病毒（Fowl adenoviruses）屬于腺病毒科的禽腺病毒屬成員，為無(wú)囊膜的雙股DNA病毒[1]。其中Ⅰ群禽腺病毒可以分為12個(gè)血清型（FAdV 1-12）。國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）將禽腺病毒的12個(gè)血清型分為5個(gè)亞群（FAdV A-E）[2]。Ⅰ群禽腺病毒可以引起包括肉雞[3]、蛋雞[4]、鴨[5]以及鵝[6，7]的多種病變。不同亞群不同血清型的Ⅰ群禽腺病毒有不同的毒力，對(duì)家禽有不同的致病能力[2]。例如血清1型（FAdV-1）（FAdV-A）和血清4型（FAdV-4）（FAdV-C）主要引起禽類的肌胃糜爛或潰瘍（GEU）[8，9]和心包積液肝炎綜合征（HHS）。而血清2、7、8a、8b、11型則在世界范圍內(nèi)引起包涵體肝炎（Inclusion body hepatitis，IBH）癥狀[20]。

包涵體肝炎（Inclusion body hepatitis，IBH）最早于1963美國(guó)發(fā)現(xiàn)[10]，1976我國(guó)臺(tái)灣報(bào)道，1988后遼寧、湖南、江蘇、吉林、河南、內(nèi)蒙古發(fā)生，2007年后又有山東、遼寧、吉林報(bào)告發(fā)生此病[11，12]。感染后發(fā)病率不高，7d～20W雞均可發(fā)生，3～7w多發(fā)。主要發(fā)生于雛雞，病雛生長(zhǎng)受阻、羽毛蓬亂、蹲伏。多于48h內(nèi)死亡或逐減康復(fù)。雞群發(fā)病后會(huì)突現(xiàn)3～5d的死亡高峰。死亡率低，可能至10%，個(gè)別可達(dá)30%。有時(shí)病程也可持續(xù)2～3d。由于目前臨床無(wú)批準(zhǔn)的禽腺病毒疫苗，禽腺病毒的流行給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的損失。

本研究從臨床采集發(fā)病雞的肝、脾、肺等病料組織病料中分離到三株病毒。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷證明所分離的病毒屬于Ⅰ群禽腺病毒（FAdV）成員，與GenBank參考序列進(jìn)行基因序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，分離株為禽腺病毒E基因型血清8b型，分離毒株為禽腺病毒的疫苗研制提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本

2016～2017年從山東省、河南省具有典型病變的肉雞肝、脾、肺等病料組織，其中兩份為山東白羽肉雞，1份為河南海蘭褐蛋雞；

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

SPF雞胚，種蛋購(gòu)自北京梅里亞維通公司，由本公司研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室孵化；SPF雞由本公司研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室孵化飼養(yǎng)；分別采集健康雞、鴨、鵝、豚鼠、兔子全血（加抗凝劑），參照2015版《中國(guó)獸藥典》附錄中“紅細(xì)胞懸液制備法”進(jìn)行配制；Taq酶、RNA酶、dNTP、DNA marker購(gòu)自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增儀為eppendorf公司產(chǎn)品；擴(kuò)增禽腺病毒 Hexon基因的特異性通用引物：FAdV-F：5’-AAT GTC CAN ACC GAR AAG GC-3’和FAdV-R：5’- CBG CBT RCA TGT ACT GGT A -3’，目的條帶大小為830bp。0.22μm濾器購(gòu)自美國(guó)Millipore。

1.3 病毒的分離及培養(yǎng)

病毒分離和傳代 取病死雞肝、脾組織，剪碎，按1：5加入滅菌PBS溶液，研磨，勻漿，-70℃反復(fù)凍融3次，12000 r/min離心10min，取上清液用0.22μm濾膜過(guò)濾，經(jīng)絨毛尿囊膜接種7日齡SPF雞胚，0.2 ml/枚，每組5枚，同時(shí)設(shè)對(duì)照組雞胚2枚，置37℃孵育。棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，將24h以后死亡的雞胚置4℃冰箱，收集尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)，同時(shí)收取胚體和絨尿膜，無(wú)菌研磨后分裝，-70℃冷凍保存?zhèn)溆?。將收獲的尿囊液和絨尿膜以及胚體研磨液100倍稀釋后，經(jīng)絨毛尿囊膜接種7日齡SPF雞胚進(jìn)行傳代。

1.4 病毒動(dòng)物回歸試驗(yàn)

取40只21日齡健康 SPF雞，分開飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組三組分別頸部皮下注射100倍稀釋的病毒液0.2ml，對(duì)照組每只注射同等劑量的無(wú)菌生理鹽水。每天觀察雞狀況。死亡雞剖檢，取肝、脾組織進(jìn)行病毒鑒定。

1.5 病毒紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)

分別取上述不同來(lái)源分離株，濃縮2倍制備成待檢病毒液。按照現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄中的“紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)法”，分別對(duì)雞、鴨、鵝、豚鼠、兔子的1%紅細(xì)胞懸液進(jìn)行凝集實(shí)驗(yàn)。

1.6 病毒目的基因測(cè)定及分析

按照參考文獻(xiàn)[2]所述的方法提取各分離株的基因組。以基因組DNA為模板，禽腺病毒 Hexon基因的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠（1.0g/L）電泳進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性的樣品目的序列克隆后送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，每份樣本進(jìn)行三次測(cè)序，并對(duì)測(cè)定的序列結(jié)果進(jìn)行BLAST（網(wǎng)址：http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離和培養(yǎng)

三份病料分別接種SPF雞胚后，實(shí)驗(yàn)組雞胚在120～240h內(nèi)死亡，未接種的對(duì)照雞胚均健康存活。與對(duì)照雞胚相比，感染胚可見絨毛尿囊膜水腫增厚，胚體全身嚴(yán)重出血，多數(shù)胚胎的肝發(fā)黃，有的有出血點(diǎn)（圖1）。每組病死雞胚尿囊液清澈，分別收獲后取樣菌檢，均無(wú)細(xì)菌和霉菌生長(zhǎng)。病毒在SPF雞胚傳代，每代均能致雞胚死亡。

2.2 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)

分離株病毒分別接種21日齡SPF雞后，在72h后開始發(fā)病，發(fā)病時(shí)相繼出現(xiàn)精神沉郁，翅膀下垂，羽毛蓬亂，屈腿蹲立（圖2），病死雞剖檢可見腫大，邊緣鈍厚，表面有大小不等出血點(diǎn)、條、斑，黃白色點(diǎn)狀、斑狀壞死灶，色澤偏黃，也可見少量心包積液。與臨床發(fā)病雞癥狀一致。實(shí)驗(yàn)組死亡率為30%～70%，對(duì)照組正常，PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組雞，禽腺病毒陽(yáng)性率100%。

圖1 病料接種SPF雞胚胚體病變照

圖2 SPF雞攻毒實(shí)驗(yàn)病變圖

2.3 紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)

分離的病毒株對(duì)雞、鴨、鵝、豚鼠、兔子的1%紅細(xì)胞懸液均無(wú)血凝性。

2.4 序列測(cè)定及分析

2.5 禽腺病毒目的基因擴(kuò)增及鑒定

各分離株Hexon基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見約830bp的目的條帶，DNA大小與預(yù)期的結(jié)果相符（圖3）。將擴(kuò)增的目的片段送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，對(duì)結(jié)果分析顯示，分離株Hexon基因序列均與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考株禽腺病毒最為相近，與參考序列FAdV-8b核苷酸同源性為97.1%～99.1%（圖3），分離株之間的核苷酸同源性為99.5%～100%。

圖3 分離株病毒PCR鑒定結(jié)果和同源性分析

2.6 目的基因序列分析

將分離株目的基因與參考序列基因使用MEGA.5[13]軟件構(gòu)建序列進(jìn)化樹，結(jié)果顯示分離的病毒與E基因型禽腺病毒血清8b型參考序列處于同一個(gè)分支（圖5），結(jié)果表明分離的病毒為禽腺病毒血清8b型。

圖5 各分離株Hexon基因序列與參考基因序列進(jìn)化樹分析（Neighbor-joining，1000 replicates）

3 結(jié)果與討論

本研究通過(guò)PCR 擴(kuò)增、序列分析和動(dòng)物試驗(yàn)，分離了3株病毒，最終確診病毒為血清8b型FAdV。使用針對(duì)Ⅰ群FAdV 的Hexon基因特異性引物可以對(duì)所有Ⅰ群FAdV進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)序分析后可進(jìn)行基因型和血清型的區(qū)分[14]。對(duì)分離株病毒經(jīng)基因分析發(fā)現(xiàn)分離株與Ⅰ群FAdV基因E型血清8b型參考毒株同處一個(gè)進(jìn)化樹分支，親緣關(guān)系較近，與參考株的同源性為97.1%～99.1，分離株之間的核苷酸同源性為99.5%～100%，表明不同地區(qū)流行的Ⅰ群禽腺病毒為同一個(gè)血清型。Ⅰ群FAdV大多在肉雞上發(fā)生于3-5周齡，偶爾會(huì)感染10-20周齡左右蛋雞和種雞[15]。本研究中，山東和河南分離株分別分離自商品白羽肉雞和蛋雞，發(fā)病日齡在三周內(nèi)，表明該病毒可以感染不同品種的雞群。符合該病的流行病學(xué)特點(diǎn)。

根據(jù)之前報(bào)道[16]，我們通過(guò)絨毛尿囊膜（CAM）途徑接種雞胚進(jìn)行禽腺病毒FAdV-4的分離，第一代即可成功分離，獲得的病毒毒價(jià)高，并能在SPF雞胚上穩(wěn)定傳代。本文中我們使用同樣方法進(jìn)行病毒分離，成功分離到三株病毒。病毒凝集對(duì)雞、鴨、鵝、豚鼠、兔子的1%紅細(xì)胞懸液均無(wú)血凝性，據(jù)報(bào)道[17]，Ⅰ群禽腺病毒中僅FAdV-1能凝集大鼠紅細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞，但目前還沒(méi)有證據(jù)表明禽的Ⅰ群腺病毒的其他血清型能凝集動(dòng)物的紅細(xì)胞。值得注意的是，分離株SD16和HN16對(duì)7日齡SPF雞胚10d內(nèi)致死率為70%左右，而分離株SD17對(duì)7日齡SPF雞胚10天內(nèi)致死率達(dá)到98%，提示臨床上FAdV-8b野毒株有毒力增強(qiáng)的可能，這需要我們對(duì)分離株進(jìn)一步的研究。

取三株病毒分別皮下接種21日齡SPF雞（100ELD50/0.2ml），實(shí)驗(yàn)組死亡率為30%～70%，對(duì)照組正常，PCR檢測(cè)所有實(shí)驗(yàn)組雞，禽腺病毒陽(yáng)性率100%。病雞羽毛蓬亂、蹲伏。解剖可見肝腫大，表面有大小不等出血點(diǎn)、條、斑，黃白色點(diǎn)狀、斑狀壞死灶，色澤變淡。也可見少量心包積液。這與臨床發(fā)病癥狀是一致的。心包積液可能是急性炎癥反應(yīng)時(shí)心包內(nèi)炎性滲出物轉(zhuǎn)化為纖維蛋白性滲出液導(dǎo)致，這可能與雞感染后急性發(fā)病死亡有關(guān)[18]，有的學(xué)者認(rèn)為還有其他病原的參與[17]。因禽腺病毒在雞群中廣泛存在且同一只雞經(jīng)常會(huì)感染多個(gè)血清型的禽腺病毒[19]，心包積液也可能是其他血清型禽腺病毒混合感染的結(jié)果。

目前，Ⅰ群禽腺病毒致病機(jī)理以及在我國(guó)的流行原因并不是很明確，因引起包涵體肝炎的有多個(gè)血清型如FAdV-E的血清型FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-D的血清型FAdV-2、FAdV-11[20]，臨床對(duì)包涵體肝炎的防控有很大的挑戰(zhàn)性。我國(guó)目前主要流行的是FAdV-4C和FAdV-8b，前者可引起心包積液肝炎綜合征，F(xiàn)AdV-11d也有報(bào)道[15]。由于臨床目前無(wú)批準(zhǔn)的疫苗，禽腺病毒給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大威脅。據(jù)國(guó)外研究報(bào)道，使用疫苗可以有效防控該病，如在6～30周齡使用FAdV-8b疫苗可以有效地防控肉（種）雞包涵體肝炎[21]。由于該病毒可垂直傳播，若種雞產(chǎn)蛋期帶毒，可大大增加商品雞發(fā)病率和死亡率。有報(bào)道指出，在肉種雞29周時(shí)肌肉注射免疫FAdV-8b疫苗，在免疫2周后產(chǎn)的種蛋孵化出的商品雞死亡率和發(fā)病率明顯降低[22，23]。因此。開發(fā)針對(duì)禽腺病毒的疫苗對(duì)防控該病具有重要意義。本研究對(duì)禽腺病毒的初步研究為疫苗的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

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