趙梅，朱傳利，文良柱，梅麗，盧敏，陳剛

（江蘇萬邦醫(yī)藥科技有限公司，江蘇徐州 221004）

肝素是一種高度硫酸化的糖胺聚糖類化合物，由相同的二糖重復(fù)單元通過1,4-糖苷鍵連接構(gòu)成，具有強力的抗凝作用，廣泛存在于哺乳動物的組織中，如肝臟、肺臟、心臟、腎臟、胎盤、腸黏液和血液中[1]。20世紀(jì)30年代，肝素開始用于臨床，現(xiàn)在已成為預(yù)防和治療靜脈血栓栓塞的主要藥物，是應(yīng)用最廣泛的抗凝血藥物[2]。2015年，全球肝素市場達到125.8億美元。

1 普通肝素

普通肝素（Unfractionated heparin，UFH）分子量在3～30kDa，平均分子量為14kDa，主要從牛肺、豬腸黏膜等動物組織器官提取獲得，石欣[3]采用豬小腸，通過鹽解、離子交換、洗滌、洗脫，沉淀，脫水、干燥制備得肝素鈉粗品。臧盛等[4]利用酶解法以豬肺為原料提取出肝素鈉粗品。肝素與凝血因子的結(jié)合位點較多，可干擾凝血過程的多個環(huán)節(jié)，出血和血小板減少發(fā)生率較高。但其在血液保存、心臟手術(shù)、腎透析、抗動脈血栓等傳統(tǒng)抗凝血臨床應(yīng)用上仍難以替代。

2 低分子量肝素

低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWH）分子量為3～8kDa，平均分子量為6kDa，其與抗凝血酶Ⅲ結(jié)合，通過抑制Xa凝血因子的活性而有效抑制血栓形成，對其他凝血因子影響小。研究結(jié)果顯示,相對于普通肝素,低分子量肝素生物利用度高，副作用小，引起出血和血小板減少的發(fā)生率更低，抗血栓作用強，半衰期更長，是治療急性靜脈血栓和急性冠脈綜合癥（心絞痛、心肌梗塞等）等疾病的首選藥物[5]。目前，低分子量肝素制品已在國內(nèi)市場占據(jù)主導(dǎo)地位。低分子量肝素的目前制備方法主要包括化學(xué)降解法、酶解法。

2.1 亞硝酸降解法

亞硝酸降解法是化學(xué)降解法制備肝素中最常用的一種制備方法，其以肝素鈉為起始原料，在一定的pH條件下，加入一定量的亞硝酸鈉解聚肝素鈉，生成低分子量肝素鈉[6]。目前已上市產(chǎn)品中達肝素、那屈肝素、舍托肝素都為亞硝酸降解法制得。亞硝酸降解法制備肝素，反應(yīng)條件溫和，成本低，產(chǎn)率高，但其制得的產(chǎn)品分子量偏高。

2.2 β-消除降解法

β-消除降解法是以肝素鈉為原料，經(jīng)成鹽、成酯、解聚和純化得到肝素鈉片段。目前已上市的藥品中依諾肝素鈉使用β用消除降解法制得。依諾肝素鈉于1993年在美國批準(zhǔn)上市，用于預(yù)防靜脈血栓栓塞性疾病。依諾肝素鈉注射液2017年銷售值15.75億歐元。銷售額居肝素類藥物首位，是全球最暢銷的抗血栓、抗凝血藥物之一。依諾肝素鈉是通過源自豬腸黏膜的肝素芐基酯的堿解聚而獲得，其平均分子量約為4.5kDa，使用100mg/mL制劑進行藥代動力學(xué)試驗，皮下注射后3～5 h出現(xiàn)最大抗Xa因子和抗Ⅱa因子活性，平均生物利用度在健康受試者中約為100%[7]。

2.3 酶解法

肝素酶是一類作用于肝素或者硫酸乙酰肝素分子的多糖裂解酶，可特異性裂解肝素大分子中的糖苷鍵，廣泛應(yīng)用于肝素寡糖及低分子量肝素制備和肝素類分子的結(jié)構(gòu)測定。已上市產(chǎn)品中亭扎肝素（商品名Innohep）使用肝素酶裂解制備。亭扎肝素1991年在歐洲上市，2000年在美國批準(zhǔn)上市。亭扎肝素的平均分子量5.5～7.5kDa，抗FXa/抗FIIa活性為1.9～2.8。給藥后主要從腎臟排泄，平均清除率1.7L/h，消除半衰期3～4h。較長的半衰期減少了每天的用量[8]。

3 超低分子量肝素

超低分子量肝素（Ultra-low molecular weight heparin，ULMWH），分子量為1.5～3kDa，與低分子量肝素相比較，分子量的分布區(qū)間更加集中，有更好的抗血栓活性，更低的出血風(fēng)險，對血小板的影響更小。在多種轉(zhuǎn)移性或局部進展性實體瘤患者中預(yù)防性使用超低分子量肝素后，靜脈血栓栓塞事件的發(fā)生率大幅降低。目前，對超低分子肝素的研究與開發(fā)已成為當(dāng)前肝素的研究熱點。邢新會等[9]使用麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶Ⅰ融合蛋白降解肝素得到超低分子量肝素，但其反應(yīng)條件苛刻，成本過高，雜質(zhì)過多難以純化。王秀云等[10]以β王消除降解法為基礎(chǔ)，通過降解、純化獲得超低分子量肝素，但其也存在著抗Xa因子效價過低，抗Ⅱa效價過高，樣品純度不夠，會有一定幾率導(dǎo)致出血的問題。而合成法合成的超低分子量肝素制品性質(zhì)穩(wěn)定均一，消除了天然提取可能引入的雜質(zhì)（如硫酸軟骨素）污染。合成法根據(jù)方法的不同可分為化學(xué)合成法和酶合成法[11]。

3.1 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法是目前成功獲得合成超低分子量肝素的方法之一，已上市產(chǎn)品有磺達肝癸納（商品名ARIXTRA）。與其他低分子量肝素制品相比較，磺達肝癸納為具有確定結(jié)構(gòu)的單一化合物，分子量為1728Da。它是目前最高效的高選擇性Xa因子抑制劑，用于術(shù)后患者治療靜脈血栓栓塞，給藥后2h達到血漿峰濃度，半衰期為17h，64%～77%經(jīng)腎臟以原形藥物排出。然而，磺達肝癸納合成步驟繁瑣，最初的合成工藝需70步以上的化學(xué)反應(yīng)，合成路線長，產(chǎn)率低，合成難度大，生產(chǎn)成本高，且合成過程易產(chǎn)生化學(xué)污染從而限制了其更好的應(yīng)用[11-12]。

3.2 酶法合成

Rosenberg等首先通過酶法合成硫酸乙酰肝素。目前，酶法合成制備肝素主要有兩種途徑：（1）以大腸桿菌K5發(fā)酵的肝素前體（Heparosan）為底物，經(jīng)化學(xué)和酶法修飾得到生物工程肝素。BKuberan等在體外條件下模擬了高爾基體內(nèi)硫酸乙酰肝素（heparan sulfate, HS）的合成，建立了酶法合成HS方法，通過大腸桿菌K5菌株制備HS前體，HS前體經(jīng)NaOH去乙?；谌谆啡趸蚬簿畚锖吞妓徕c的作用下發(fā)生N硫酸化，之后在C5異構(gòu)化酶、2-OST1、6-OST1、6-OST2a以及3-OST1的作用下反應(yīng)得到抗凝血的硫酸乙酰肝素多糖[13]。（2）以二糖為起始底物經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶以UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰葡萄糖胺（或UDP-N-三氟乙酰葡萄糖胺）為單糖供體逐個添加單糖得到多糖骨架，并經(jīng)化學(xué)和酶法修飾得到超低分子量肝素[11]。劉健等報道了體外酶法合成超低分子肝素的途徑，GlcUA在肝素前體合成酶2（pmHS2）的催化作用下從UDPGlcUA轉(zhuǎn)移到糖鏈上，N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）或N-三氟乙酰葡萄糖胺（GlcNTFA）在N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的催化作用下從UDP-GlcNAc或UDP-GlcNTFA轉(zhuǎn)移到糖鏈上，這兩個反應(yīng)交替進行，延伸合成肝素多糖骨架。C5異構(gòu)化酶和2-OST、6-OST以及3-OST催化下進行硫磺基團修飾，合成肝素化合物[14]。徐永梅等通過酶法合成了與抗凝血酶相互作用并顯示出抗Xa活性的八糖，大鼠模型試驗顯示其比磺達肝癸納有更快的清除率，有望開發(fā)成為短效抗凝血藥物[15]。

然而，酶法合成肝素技術(shù)仍然面臨很多難點，例如，肝素修飾酶硫磺基供體3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate，PAPS）價格昂貴且易分解，酶法合成產(chǎn)量不高；肝素修飾酶的表達量低，很難大量獲得，這些因素限制了酶法合成肝素的規(guī)?；a(chǎn)[11]。

4 結(jié)語

我國是全球最大的肝素類產(chǎn)品出口國，出口結(jié)構(gòu)上，肝素粗品占比重最大，低分子量肝素增長較快，當(dāng)前龐大的應(yīng)用群體和肝素類藥物臨床應(yīng)用的發(fā)展使市場需求不斷增長。2008年肝素鈉致死事件之后，歐美等國不斷提高肝素類藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)管要求[16]。而目前藥用肝素主要來源于豬小腸提取物，最終產(chǎn)品分子量分布范圍廣，在生產(chǎn)過程中不但受到小腸來源與質(zhì)量的制約，產(chǎn)品還存在著易受動物源性病原體，如病毒、朊病毒等污染的風(fēng)險。合成法合成肝素，避免了動物源肝素生產(chǎn)過程中可能引入的雜質(zhì)，可以獲得性質(zhì)穩(wěn)定均一的藥物級純度的肝素替代傳統(tǒng)動物源肝素，很有開發(fā)前途。