逄雪超，徐　燕，紀(jì)麗云

(上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院，上?！?00240)

結(jié)直腸癌是一種發(fā)于結(jié)腸或者直腸的癌癥，屬于消化系統(tǒng)，又稱為胃腸消化道癌癥，是世界高發(fā)惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年發(fā)展中國(guó)家新增病例超過(guò)77.7萬(wàn)例，死亡人數(shù)達(dá)35萬(wàn)人[1]。結(jié)直腸癌(CRC)早期治療生存率高，但由于缺乏足夠特異性和敏感性的腫瘤標(biāo)志物，大多數(shù)患者在結(jié)直腸癌晚期才被確診，延誤了最佳治療時(shí)間。在組織癌變過(guò)程中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能極有可能受到CRC發(fā)生、發(fā)展的影響，產(chǎn)生相應(yīng)的變化。外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)作為免疫系統(tǒng)的重要組分，包括單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞，是研究免疫變化的理想材料。近年來(lái)，大量研究表明，癌癥的發(fā)生、發(fā)展與PBMC息息相關(guān)[2-3]。

為了找到CRC患者PBMC中的差異表達(dá)蛋白，以及研究CRC的發(fā)生對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，本研究擬采用最新的經(jīng)典數(shù)據(jù)非依賴性質(zhì)譜掃描技術(shù)(DIA)，將整個(gè)MS1的掃描范圍等分為若干窗口，每個(gè)窗口依次選擇、碎裂、采集窗口內(nèi)所有母離子的全部子離子信息。運(yùn)用Skyline軟件對(duì)DIA的采集結(jié)果進(jìn)行處理，以實(shí)現(xiàn)蛋白的定量分析，并比較結(jié)直腸癌患者與良性腸病患者PBMC蛋白的差異表達(dá)，以期找到CRC的早期標(biāo)志物并闡明PBMC的變化，為CRC的診斷或免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器

QE-plus質(zhì)譜儀、EASY-nLC-1000 UPLC納升液相色譜儀、-80 ℃超低溫冰箱、低溫離心機(jī)：均為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Tek公司產(chǎn)品；Newclassic MF分析天平：瑞士Mettler-Toledo公司產(chǎn)品；除鹽系統(tǒng)：美國(guó)Supelco公司產(chǎn)品。

1.2　試劑

碳酸氫銨、氫氧化鈉、尿素、氯化銨、氯化鈣、碘乙酰胺：均為化學(xué)純，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；甲酸(FA)：德國(guó)CNW公司產(chǎn)品；酸不穩(wěn)定表面活性劑(ALS)：美國(guó)系統(tǒng)生物研究所產(chǎn)品；TCEP(tris(2-carboxyethyl) phosphine)：美國(guó)Fluka公司產(chǎn)品；HEPES(tris-(2-carboxyethyl) phosphine)：生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；乙腈(ACN)：美國(guó)Sigma Aldrich公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail tablets)：德國(guó)Roche公司產(chǎn)品。

1.3　病例信息

收集2016年3月至4月上海新華醫(yī)院樣本11例，其中6例結(jié)直腸癌患者術(shù)前樣本，5例腸道其他疾病(非瘤或良性瘤)樣本。取血后4 h內(nèi)用人類淋巴細(xì)胞分離管收集PBMC，于-80 ℃保存，備用。

1.4　樣品準(zhǔn)備

1.4.1細(xì)胞裂解將200 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(0.2%ALS，20 mmol/L HEPES，1X蛋白酶抑制劑)加入裝有PBMC的EP管中，吹散細(xì)胞并在冰上振蕩裂解25 min，低溫4 ℃，以13 000 r/min離心20 min，取上清液，于-80 ℃保存，備用。

1.4.2蛋白酶解采用蛋白濃度測(cè)定試劑盒(BCA)法確定蛋白質(zhì)濃度后，取30 μg蛋白，在37 ℃下，6 mol/L尿素中變性30 min；在5 mmol/L TCEP中還原，55 ℃下反應(yīng)30 min；加入碘乙酰胺(IAA)使終濃度為6.25 mmol/L，室溫下避光反應(yīng)1 h。用6倍樣品體積的50 mmol/L AMBIC稀釋，使尿素濃度低于1 mol/L。加入CaCl2使終濃度為1 mmol/L，用NaOH調(diào)至pH 8；加胰酶(胰酶質(zhì)量∶蛋白質(zhì)量= 1∶100)，于37 ℃過(guò)夜反應(yīng)16 h。用C18填料的96孔除鹽柱除鹽，冷凍離心機(jī)干燥，于-20 ℃保存，等待上樣。

1.5　數(shù)據(jù)采集

1.5.1譜圖庫(kù)的建立采用數(shù)據(jù)依賴性(DDA)模式對(duì)11個(gè)樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，每份樣品采用Easy-LC 1000 UPLC串聯(lián)Q-Exactive Plus進(jìn)行分離和檢測(cè)，上樣量1 μg。流動(dòng)相：A相為0.1%FA-H2O，B相為0.1%FA-80%ACN；洗脫梯度：0～5 min(3%～7%B)，5～55 min(7%～22%B)，55～65 min(22%～35%B)，65～68 min(35%～80%B)，68～75 min(80%B)。正離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z400～1 200。DDA數(shù)據(jù)采用Trans-Proteomic Pipeline(TPP) 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，數(shù)據(jù)庫(kù)為Uniport非冗余庫(kù)(2 014.9)，胰酶漏切位點(diǎn)設(shè)為0；固定修飾半胱氨酸烷基化(57.021 46 u)，非固定修飾甲硫氨酸氧化(15.994 9 u)；母離子誤差范圍控制在10-5內(nèi)，二級(jí)碎片誤差控制在0.02 u內(nèi)。用TPP將11個(gè)搜庫(kù)結(jié)果整合建庫(kù)導(dǎo)入Skyline，用于DIA的數(shù)據(jù)分析。

1.5.2DIA-MS數(shù)據(jù)獲取及處理采用與DDA采集一致的液相分離梯度，對(duì)11個(gè)樣本進(jìn)行DIA數(shù)據(jù)采集，將質(zhì)量掃描范圍m/z400～1 200等分成32個(gè)連續(xù)的25 u窗口，每個(gè)窗口內(nèi)依次選擇、碎裂、采集所有母離子的全部子離子信息用于定量，重復(fù)2次。采用Skyline(Skyline-daily 3.5.1.9283)軟件進(jìn)行非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析。將DIA數(shù)據(jù)導(dǎo)入，進(jìn)行蛋白定量信息的篩選和提取。采用Skyline自動(dòng)輔助功能篩選合適的色譜峰，方法參考Skyline官網(wǎng)數(shù)據(jù)非依賴采集數(shù)據(jù)處理教程，只考慮+1和+2價(jià)子離子，用肽段特征碎片離子提取面積之和對(duì)肽段進(jìn)行定量，導(dǎo)出包含蛋白名稱、多肽序列及子離子面積的信息。

采用R(version 3.2.2)軟件對(duì)兩次DIA定量數(shù)據(jù)用總離子強(qiáng)度(TIC)進(jìn)行歸一化處理，取兩次結(jié)果的平均值用于后續(xù)分析。分別刪除癌癥組和對(duì)照組中樣本間超過(guò)20%的子離子定量信息為0的子離子，保留兩組樣本中子離子定量相關(guān)性大于0.6的肽段。將同一肽段子離子面積加和歸到肽段水平，在肽段水平進(jìn)行雙尾t檢驗(yàn)，篩選具有顯著差異的肽段(p<0.05)，然后歸到蛋白水平，找到差異表達(dá)蛋白。

DAVID是一個(gè)旨在從大批量的基因數(shù)據(jù)或蛋白數(shù)據(jù)中系統(tǒng)提取生物信息，整合完整生物數(shù)據(jù)的分析工具[4]。它是研究蛋白質(zhì)功能及生物信號(hào)通路的有力手段，應(yīng)用DAVID從蛋白質(zhì)的生物過(guò)程(biological process)、分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)3個(gè)方面分別對(duì)上調(diào)和下調(diào)的蛋白進(jìn)行基因富集分析，分類嚴(yán)格等級(jí)設(shè)為高。使用Reactome對(duì)上調(diào)和下調(diào)的差異蛋白做通路分析。

2　結(jié)果與討論

2.1　差異蛋白分析

11個(gè)樣本DDA數(shù)據(jù)建庫(kù)，共得到11 657條肽，2 585個(gè)蛋白，其中用Skyline軟件定量到760個(gè)蛋白。對(duì)定量到的760個(gè)蛋白進(jìn)行t檢驗(yàn)，共得到113個(gè)差異蛋白(p<0.05)，其中結(jié)直腸癌癥組相比于良性結(jié)直腸疾病組，包含上調(diào)差異蛋白23個(gè)，下調(diào)差異蛋白90個(gè)。用這些差異蛋白聚類分析可以將結(jié)直腸癌組與良性結(jié)直腸疾病組明顯的分成兩類，示于圖1。然后進(jìn)行GO聚類分析，采用Benjamini校正法校正p值，導(dǎo)出校正后p<0.05的結(jié)果進(jìn)一步探究。細(xì)胞組分分析結(jié)果顯示，下調(diào)蛋白多為胞外組分，包括胞外外泌體、胞外膜結(jié)構(gòu)、胞外囊泡和胞外體等；生物過(guò)程分析顯示，下調(diào)差異蛋白主要參與的生物過(guò)程有血小板脫顆粒、調(diào)控細(xì)胞外泌、胞外分泌、囊泡調(diào)控的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程及細(xì)胞分泌過(guò)程等；分子功能分析結(jié)果顯示，下調(diào)的差異蛋白多與細(xì)胞黏附、胞間粘著、鈣粘蛋白參與的細(xì)胞間黏附等作用有關(guān)。這些結(jié)果表明，癌癥患者的外周單核細(xì)胞的蛋白合成、蛋白分泌等可能發(fā)生了變化；并且細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也可能發(fā)生了變化，暗示著免疫細(xì)胞及免疫系統(tǒng)受到了調(diào)控。上調(diào)蛋白GO聚類分析結(jié)果經(jīng)校正后p值均大于0.05。用Reactome對(duì)差異蛋白做通路分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)差異蛋白主要涉及SRP-依賴的翻譯蛋白靶向膜通路；而下調(diào)差異蛋白涉及通路主要包括MAP2K和MAPK激活、一系列整合素相關(guān)通路、纖維蛋白凝血通路、RHOGTPase激活PAKs 及激活PKNs通路，其結(jié)果列于表1。

2.2　差異蛋白中與免疫直接相關(guān)的蛋白

本研究共篩選出113個(gè)差異蛋白(p<0.05)，其中差異倍數(shù)≥2的差異蛋白67個(gè)，上調(diào)蛋白23個(gè)，下調(diào)蛋白44個(gè)，分別列于表2和表3。在發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)蛋白中，Galectin-1、Dok-2、AHNAK1等蛋白與機(jī)體的免疫功能息息相關(guān)，它們參與巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等多種外周免疫細(xì)胞的免疫活動(dòng)。

Galectin-1(P09382, LEG1)是最早發(fā)現(xiàn)的Gal家族二聚體分子[5]，在免疫系統(tǒng)中，Gal一般存在于激活的巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞以及T細(xì)胞[6-8]中。隨著各種生物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究證明這種內(nèi)源性的凝集素是一種非常重要的調(diào)節(jié)固有及獲得性免疫的調(diào)控分子[9-14]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌癥患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中，Galectin-1蛋白發(fā)生了極其顯著的高表達(dá)現(xiàn)象，說(shuō)明患者體內(nèi)免疫細(xì)胞被激活，即在CRC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，機(jī)體可能發(fā)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)。Rabinovich等[9]研究證明，Galectin-1在人類的單核細(xì)胞中可以通過(guò)觸發(fā)MAPK中ERK1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的生理機(jī)能，從而影響機(jī)體的固有免疫和獲得性免疫功能。這些研究都說(shuō)明，該蛋白過(guò)表達(dá)與機(jī)體免疫息息相關(guān)，結(jié)合本研究的信號(hào)通路分析結(jié)果，差異蛋白被富集到MAPK通路，暗示在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，PBMC中Galectin-1蛋白發(fā)生顯著變化的分子原理，Galectin-1很有可能成為CRC的分子標(biāo)志物。

Dok-2(O60496, DOK2)是DOK(downstream of tyrosine kinase)家族成員，目前已發(fā)現(xiàn)該家族包含7個(gè)蛋白[15]，在眾多免疫細(xì)胞中，Dok-2蛋白多在T細(xì)胞及髓系細(xì)胞中表達(dá)[16-17]，大量研究報(bào)道Dok-2蛋白與Dok-1蛋白共同作用負(fù)調(diào)控T細(xì)胞的免疫活動(dòng)[16,18-19]。同時(shí)，Yamanashi等[20]通過(guò)測(cè)定敲除Dok-1和Dok-2基因的小鼠活化巨噬細(xì)胞分泌物，證明了Dok-1和Dok-2蛋白在巨噬細(xì)胞的TLR4信號(hào)活動(dòng)中起負(fù)調(diào)控作用，從而推測(cè)其可能影響機(jī)體的固有免疫功能。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)該蛋白在癌癥組明顯下調(diào)的結(jié)果，說(shuō)明在癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，免疫細(xì)胞可能做出了免疫響應(yīng)以應(yīng)對(duì)癌癥的發(fā)生，Dok-2蛋白在結(jié)直腸癌患者的PBMC中明顯低表達(dá)，其有望成為結(jié)直腸癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的診斷標(biāo)志物。

注：CA代表蛋白結(jié)直腸癌患者；NA代表良性腸類疾病患者圖1　113個(gè)差異蛋白聚類分析Fig.1　Unsupervised hierarchical clustering of 113 differentially expressed proteins

通路序號(hào)PathwayID名稱Name數(shù)目Count百分比Percent/%校正后結(jié)果BenjaminiDown-regulatedR-HSA-114608Plateletdegranulation2122.111.895×10-20R-HSA-5674135MAP2KandMAPKactivation88.422.459×10-6R-HSA-354194GRB2:SOSprovideslinkagetoMAPKsignalingforintegrins66.325.587×10-6R-HSA-372708P130CaslinkagetoMAPKsignalingforintegrins66.325.587×10-6R-HSA-354192IntegrinalphaIIbbeta3signaling66.324.467×10-5R-HSA-140875Commonpathwayoffibrinclotformation55.260.0010291R-HSA-216083Integrincellsurfaceinteractions66.320.0206406R-HSA-5627123RHOGTPasesactivatePAKs44.210.0258562R-HSA-5625740RHOGTPasesactivatePKNs44.210.0356186Up-regulatedR-HSA-1799339SRP-dependentcotranslationalproteintargetingtomembrane422.200.034

表2　結(jié)直腸癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞上調(diào)蛋白Table 2　Up regulated proteins in PBMC of CRC

AHNAK1(Q09666, AHNK)是一個(gè)分子質(zhì)量接近700 u的蛋白，在CD4+T細(xì)胞中高表達(dá)，參與調(diào)控Ca2+-calcineurin-NFAT信號(hào)通路[21]，是該通路中的重要組分，該信號(hào)通路調(diào)節(jié)T細(xì)胞的激活、增殖以及細(xì)胞因子的分泌等免疫活動(dòng)[22]。Matza等[21]研究表明，鈣離子信號(hào)通路對(duì)于T細(xì)胞的激活發(fā)揮了重要作用。為研究該蛋白對(duì)T細(xì)胞功能的影響，對(duì)比了AHNAK1基因敲除鼠和普通小鼠在發(fā)生感染時(shí)，CD4+T細(xì)胞的IFN-γ分泌情況，發(fā)現(xiàn)AHNAK1基因敲除鼠IFN-γ的分泌受到了嚴(yán)重?fù)p害，這表明AHNAK1蛋白對(duì)Th1免疫應(yīng)答具有重要的調(diào)節(jié)作用，這是因?yàn)門h1的免疫應(yīng)答主要是通過(guò)分泌IFN-γ來(lái)發(fā)揮作用的。結(jié)合本研究癌癥組AHNAK1蛋白低表達(dá)的結(jié)果，推測(cè)癌癥組T細(xì)胞Th1活性可能受到了抑制，AHNAK1具有成為結(jié)直腸癌標(biāo)志物的潛力。

表3　結(jié)直腸癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞下調(diào)蛋白Table 3　Down regulated proteins in PBMC of CRC

3　結(jié)論

目前，LC/MS已成為復(fù)雜樣本中通量分析蛋白和小分子的主流工具[23]。本研究采用的DIA-MS定量技術(shù)相比于DDA相對(duì)定量技術(shù)及MRM-MS定量技術(shù)，無(wú)需指定目標(biāo)肽段、通量無(wú)上限、掃描點(diǎn)數(shù)均勻，可獲得固定質(zhì)量范圍內(nèi)母離子的全部子離子信息，利用譜圖庫(kù)即可實(shí)現(xiàn)定性確證和定量離子篩選，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)隨時(shí)回溯和生物樣本信息數(shù)字化[24-25]。但DIA數(shù)據(jù)采集亦有一定的局限性，比如：難以使用超高分辨率掃描模式、大窗口引入較大干擾、依賴DDA形成的譜圖庫(kù)才能實(shí)現(xiàn)蛋白的定性、定量[24,26]。本研究在Q-Exactive plus平臺(tái)上完成了經(jīng)典DIA數(shù)據(jù)采集，借助Skyline軟件完成了通量蛋白的定量，并找到一系列結(jié)直腸癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞差異蛋白。結(jié)直腸癌的形成是一個(gè)長(zhǎng)期的先天與后天、機(jī)體與內(nèi)分泌相互作用的復(fù)雜過(guò)程[27]。在這個(gè)復(fù)雜而漫長(zhǎng)的疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，機(jī)體的很多方面發(fā)生了變化，包括基因、代謝、蛋白等。因此，理解結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制對(duì)于診斷和治療該疾病具有重要的意義[28]。當(dāng)癌癥發(fā)生時(shí)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)會(huì)因?yàn)樽R(shí)別癌變或癌癥入侵免疫系統(tǒng)而發(fā)生變化。近年來(lái)，許多研究證實(shí)，當(dāng)惡性腫瘤或惡性疾病發(fā)生時(shí)，機(jī)體的PBMC會(huì)發(fā)生顯著變化，包括基因組[29]、轉(zhuǎn)錄組[3]、蛋白組[30]等，但對(duì)癌癥發(fā)生時(shí)的PBMC蛋白組研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用DIA蛋白定量方法對(duì)結(jié)直腸癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞蛋白進(jìn)行初步探究，篩選得到一批在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)生顯著變化的蛋白，這些蛋白有望成為CRC的疾病診斷標(biāo)志物或癌癥免疫治療的靶點(diǎn)，但這仍需要進(jìn)一步的大樣本分析驗(yàn)證、靶向定量或生物學(xué)驗(yàn)證。并應(yīng)用DIA-MS在外周血單核細(xì)胞中尋找到CRC與非惡性腸病的差異表達(dá)蛋白，可以基于以上結(jié)果進(jìn)行后續(xù)研究。同時(shí)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，譜圖庫(kù)更加完整，DIA數(shù)據(jù)可隨時(shí)被回溯分析，從歷史樣本中可分析得到新的有價(jià)值的信息。

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