張聰聰，張晶晶▲，武垣伶，戴雍月，錢小英，王萬鐵△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，浙江 溫州 325035； 2溫州市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是造成我國(guó)慢性肺源性心臟病(肺心病)的主要原因[1]。肺心病具有預(yù)后不佳和進(jìn)展較快的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響我國(guó)城鄉(xiāng)居民的健康[2-3]。肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是肺心病的特征性改變，直接影響肺心病的預(yù)后[4]，并且其發(fā)生同時(shí)往往伴隨著肺泡和血液中二氧化碳分壓升高[5]。

低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓(hypoxia-hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH)是一個(gè)多因子參與的病理過程，肺血管收縮反應(yīng)(pulmonary vasoconstriction，PV)和肺血管重構(gòu)(pulmonary vascular remodeling，PVSR)是2個(gè)主要的發(fā)病環(huán)節(jié)[6]。近年來的研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，EndoMT)可能參與PVSR過程[7]。其中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)家族和其下游的Smads信號(hào)通路與EndoMT的發(fā)生有著密切的關(guān)系[8]。

益氣溫陽活血化痰方(Yiqi-Wenyang-Huoxue-Huatan formula，YWHHF)，全方組成：黃芪、人參、附片、川芎、丹參、法夏、薤白和白芥子等。研究表明，黃芪和丹參等對(duì)心、肺及腦相關(guān)疾病具有一定的治療作用[9-10]，但其是否能緩解低氧高二氧化碳引起的肺動(dòng)脈高壓，目前尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探究益氣溫陽活血化痰方在低氧高二氧化碳情況下與肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用及與TGF-β/Smads信號(hào)通路的關(guān)系，從而探討益氣溫陽活血化痰方可能的作用機(jī)制，為臨床防治肺動(dòng)脈高壓癥提供理論指導(dǎo)。

材　料　和　方　法

1　動(dòng)物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，清潔級(jí)，體重為(200±20) g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(浙)2015-0009。

2　主要試劑

益氣溫陽活血化痰方(北京中醫(yī)藥大學(xué)組方)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)；兔抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和TGF-β1抗體及小鼠抗大鼠CD31抗體(Abcam)；兔抗大鼠Smad2/3和p-Smad2/3抗體(Cell Signaling Technology)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 II 抗和辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠 II 抗(博蘊(yùn)生物科技有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)(碧云天)；PVDF膜(Millipore)；瓊脂糖凝膠(Bio-Rad)；所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

3　主要方法

3.1中藥制備將藥材磨成粉狀，于冷水中浸泡1 h,多功能提取罐煎煮2次,每次90 min，合并2次濾液，置于4 ℃冷藏。分裝濾液于EP管中，真空冷凍干燥處理，并于陰涼處保存。按體表面積折算率換算成大鼠等效劑量，按濃度分為高劑量(200 g/L)組、中劑量(100 g/L)組和低劑量(50 g/L)組，灌胃前用生理鹽水溶解，并將溶液置于37 ℃水浴鍋20 min，避免大鼠出現(xiàn)腹瀉等現(xiàn)象[11]。

3.2實(shí)驗(yàn)分組將50只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為5組(n=10)：常氧對(duì)照(normal control，N)組、低氧高二氧化碳(hypoxia-hypercapnia，HH)組、YWHHF高劑量(high-dose YWHHF，YH)組、YWHHF中劑量(middle-dose YWHHF，YM)組和YWHHF低劑量(low-dose YWHHF，YL)組。

3.3HHPH動(dòng)物模型的制備N組置于常氧環(huán)境，自由呼吸空氣，飼養(yǎng)4周；其余4組置于低氧高二氧化碳(10% O2和5% CO2)氧艙中飼養(yǎng)，HH組進(jìn)倉(cāng)前用等體積的生理鹽水灌胃，各中藥組用等體積的YWHHF灌胃，YH組劑量為0.6 g/kg，YM組劑量為0.3 g/kg，YL組劑量為0.15 g/kg，倉(cāng)內(nèi)多余CO2用氫氧化鈉吸收8 h/d，每周6 d，飼養(yǎng)4周。

3.4大鼠平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)和平均頸動(dòng)脈壓(mean carotid artery pressure，mCAP)的檢測(cè)用10%的水合氯醛以350 mL/kg麻醉大鼠，消毒后分離皮下組織和肌肉，暴露頸外靜脈，并在其上剪一個(gè)2～3 mm的“V”形切口，將PE導(dǎo)管慢慢往里推送，直至出現(xiàn)波幅較心室波小且波形較規(guī)則的肺動(dòng)脈壓力波形，記錄肺動(dòng)脈壓并保存; 剪開大鼠左側(cè)頸部的皮毛，暴露頸總動(dòng)脈，用小型動(dòng)脈夾分別夾住動(dòng)脈的近心端和離心端，剪2～3 mm的“V”形切口，將PE導(dǎo)管插入頸總動(dòng)脈，記錄頸動(dòng)脈壓并保存。

3.5右心室肥大指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)的測(cè)量測(cè)完壓力后用生理鹽水灌洗，直至肺葉呈白色，剪下心臟及肺葉至PBS中漂洗，沿房室溝剪去心房，分離右心室(right ventricle，RV)及左心室(left ventricle，LV)加心室間隔(interventri-cular septum，IVS)(LV+S)，用濾紙吸干，電子天平稱重，計(jì)算RV/(LV+S)的質(zhì)量比，即右心室肥大指數(shù)，以此作為判斷右心室肥厚程度。

3.6肺組織的HE染色觀察留取右中肺葉用4%的多聚甲醛浸泡48 h至1周，脫水后常規(guī)石蠟切片，HE染色，觀察。

3.7肺組織的免疫熒光觀察取各組大鼠肺葉，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，60 ℃恒溫烤箱中烤片2 h，經(jīng)過脫蠟、水化、封閉，滴加兔抗大鼠α-SMA和小鼠抗大鼠CD31的抗體(稀釋比均為1∶100)，4 ℃過夜。第2天PBS沖洗3次，每次5 min，滴加 II 抗，37 ℃孵育30 min，50%防淬滅緩沖甘油封片，用正置熒光顯微鏡觀察并拍片。

3.8RT-PCR檢測(cè)α-SMA、CD31、TGF-β1和Smad2/3的mRNA表達(dá)水平取大鼠肺組織 100 mg，加液氮在研缽里研磨，以Trizol法提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成及擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：(1)β-actin:95 ℃(預(yù)變性)6 min； 95 ℃(變性)1 min、54 ℃(退火)1 min、72 ℃(延伸)1 min，32個(gè)循環(huán); 72 ℃(終止延伸)10 min。(2)α-SMA：94 ℃(預(yù)變性)3 min； 94 ℃(變性)30 s、53.9 ℃(退火)30 s、72 ℃(延伸)1 min，32個(gè)循環(huán); 72 ℃(終止延伸)5 min。(3)CD31：94 ℃(預(yù)變性)3 min； 94 ℃(變性)30 s、 51.2 ℃(退火)30 s、72 ℃(延伸)1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃(終止延伸)5 min。(4)TGF-β1：94 ℃(預(yù)變性)3 min、94 ℃(變性)30 s、51.1 ℃(退火)30 s、72 ℃(延伸)1 min，32個(gè)循環(huán)； 72 ℃(終止延伸)5 min。(5)Smad2/3：94 ℃(預(yù)變性)3 min； 94 ℃(變性)30 s、53.7 ℃(退火)30 s、72 ℃(延伸)1 min，32個(gè)循環(huán); 72 ℃(終止延伸)5 min。引物序列見表1。

表1　PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-PCR

3.9Western blot測(cè)定各組α-SMA、CD31、TGF-β1和p-Smad2/3的蛋白水平取100 mg各組大鼠肺組織，加液氨在研缽里充分研磨，用1 mL RIPA 和 10 μL PMSF裂解肺組織，待裂解充分后，12 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。電泳結(jié)束后截取相應(yīng)位置的膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，用 I 抗稀釋液稀釋 I 抗(α-SMA、CD31、TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3抗體均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，用HRP標(biāo)記的 II (CD31為山羊抗鼠IgG，1∶10 000； α-SMA、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3和GAPDH為山羊抗兔IgG，1∶10 000)抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，置于曝光儀曝光，用Quantity One軟件分析條帶灰度值，用目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值之比表示目的蛋白的表達(dá)水平，用p-Smad2/3與Smad2/3的比值反映p-Smad2/3蛋白的磷酸化水平。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差齊性者兩兩比較采用SNK-q法,方差不齊者進(jìn)行Dunnett T3 檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓、平均頸動(dòng)脈壓及右心室肥大指數(shù)的比較

與N組相比，其余4組的mPAP均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01)，RV/(LV+S)均顯著增大(P<0.01)；與HH組相比，YH、YM和YL組的mPAP均有不同程度降低(P<0.01)，RV/(LV+S)也有相應(yīng)降低趨勢(shì)(P<0.01或P<0.05)；與YL組比，YH組和YM組的mPAP均降低(P<0.01)，并以YM組下降最顯著。各組勁動(dòng)脈平均壓力值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2各組大鼠mPAP、mCAP及RV/(LV+S)的變化
Table 2.The changes of mPAP,mCAP and RV/(LV+S) in the rats with different treatments (Mean±SD.n=10)

GroupmPAP(mmHg)mCAP(mmHg)RV/(LV+S)(%)N13．21±1．30　　102．64±4．0122．20±1．01HH28．27±2．01??121．64±3．9635．02±2．88??YH22．81±2．34??△△##119．34±4．4527．41±1．46??△△YM22．69±2．89??△△##124．52±3．8727．56±1．97??△△YL25．76±3．01?△△109．47±4．3331．84±1．68??△

*P<0.05，**P<0.01vsN group;△P<0.05,△△P<0.01vsHH group;##P<0.01vsYL group.

2　各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)光鏡觀察結(jié)果

與N組相比，HH組及各中藥組肺動(dòng)脈平滑肌均有不同程度增殖，中膜層有不同程度增厚，血管管壁面積(wall area，WA)/總面積(total area，TA)均升高(P<0.01或P<0.05)，血管管腔面積(lumen area，LA)/TA均降低(P<0.01或P<0.05)；與HH組比，各中藥組肺動(dòng)脈平滑肌的增殖有不同程度的降低,中膜厚度有不同程度下降，管腔面積增加明顯，WA/TA均降低(P<0.01或P<0.05)，LA/TA均升高(P<0.01或P<0.05)，見圖1、表3。

Figure 1.HE staining of pulmonary arteries in each group (×40).The red rectangle area is the characteristic change area of the pulmonary artery.
圖1各組大鼠肺動(dòng)脈HE染色結(jié)果

表3各組大鼠WA/TA和LA/TA值的比較
Table 3.The changes of WA/TA and LA/TA values of the rats with different treatments (%.Mean±SD.n=10)

GroupWA/TALA/TAN29．12±5．0667．02±6．22HH62．33±2．88??37．86±2．01??YH49．36±2．96??△△#53．61±2．98???△△##YM50．44±3．02??△△#51．73±3．01?△△##YL59．97±4．86?△44．56±5．68?△

*P<0.05，**P<0.01vsN group;△P<0.05△△P<0.01vsHH group;#P<0.05,##P<0.01vsYL group.

3　免疫熒光法測(cè)定大鼠肺動(dòng)脈壁CD31和α-SMA的表達(dá)

在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，CD31用來證明內(nèi)皮細(xì)胞的存在，是其特異性標(biāo)志物，常表達(dá)于血管內(nèi)膜，α-SMA是間充質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，常表達(dá)于血管中膜。各組大鼠肺動(dòng)脈壁免疫熒光圖中CD31呈綠色，α-SMA呈紅色，熒光強(qiáng)度代表各自表達(dá)量。結(jié)果如下：N組可見CD31沿內(nèi)膜分布，強(qiáng)度高，α-SMA在中膜分布，強(qiáng)度一般；HH組CD31脫落明顯，少見，α-SMA在動(dòng)脈各層彌散分布，強(qiáng)度高；YH組及YM組CD31強(qiáng)度一般，α-SMA強(qiáng)度中等；YL組CD31強(qiáng)度較弱，α-SMA分布較強(qiáng)，見圖2。

Figure 2.Immunofluorescence of pulmonary arteries in each group (×40).The white arrow is defined as a distinct change area.
圖2各組大鼠肺動(dòng)脈壁免疫熒光圖

4　各組大鼠肺組織α-SMA、CD31、TGF-β1和Smad2/3的mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

與N組比，低氧高二氧化碳時(shí)α-SMA、TGF-β1和Smad2/3的mRNA水平均明顯增高(P<0.01)，CD31的mRNA水平明顯降低(P<0.01)；與HH組比，YM組和YH組α-SMA、TGF-β1和Smad2/3的mRNA水平有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01),YL組α-SMA和Smad2/3的mRNA水平有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01)，但TGF-β1無明顯改變，YM組、YH組和YL組CD31的mRNA水平均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01)，見圖3～6。

Figure 3.The mRNA expression of α-SMA in each group.Mean±SD.n=10.**P<0.01vsN group;△△P<0.01vsHH group.
圖3各組大鼠肺組織α-SMA的mRNA表達(dá)水平

Figure 4.The mRNA expression of CD31 in each group.Mean±SD.n=10.**P<0.01vsN group;△P<0.05，△△P<0.01vsHH group;#P<0.05vsYL group.
圖4各組大鼠肺組織CD31的mRNA表達(dá)水平

5　各組大鼠肺組織α-SMA、CD31、TGF-β1和p-Smad2/3 蛋白水平的比較

與N組比，低氧高二氧化碳時(shí)α-SMA、TGF-β1和p-Smad2/3的蛋白水平均明顯增高，CD31的蛋白水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與HH組比，YM組和YH組α-SMA、TGF-β1和p-Smad2/3的蛋白水平有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01),YL組的p-Smad2/3蛋白水平有不同程度的降低(P<0.05)，但α-SMA和TGF-β1無明顯改變；YM組、YH組和YL組CD31的蛋白水平均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01)，見圖7～10。

Figure 5.The mRNA expression of TGF-β1 in each group.Mean±SD.n=10.**P<0.01vsN group;△P<0.05，△△P<0.01vsHH group.
圖5各組大鼠肺組織TGF-β1的mRNA表達(dá)水平

Figure 6.The mRNA expression of Smad2/3 in each group.Mean±SD.n=10.**P<0.01vsN group;△P<0.05,△△P<0.01vsHH group;#P<0.05,##P<0.01vsYL group.
圖6各組大鼠肺組織Smad2/3的mRNA表達(dá)水平

Figure 7.The protein expression of α-SMA in each group.Mean±SD.n=10.**P<0.01vsN group;△△P<0.01vsHH group;#P<0.05vsYL group.
圖7各組大鼠肺組織α-SMA蛋白的表達(dá)水平

Figure 8.The protein expression of CD31 in each group.Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01vsN group;△P<0.05,△△P<0.01vsHH group;#P<0.05vsYL group.
圖8各組大鼠肺組織CD31蛋白的表達(dá)水平

Figure 9.The protein expression of TGF-β1 in each group.Mean±SD.n=10.**P<0.01vsN group;△P<0.05,△△P<0.01vsHH group.
圖9各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白的表達(dá)水平

Figure 10.The protein levels of p-Smad2/3 in each group.Mean±SD.n=10.*P<0.05;**P<0.01vsN group;△P<0.05,△△P<0.01vsHH group;##P<0.01vsYL group.
圖10各組大鼠肺組織p-Smad2/3蛋白水平的比較

6　各組大鼠mPAP、WA/TA、LA/TA、α-SMA、CD31、TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3 mRNA和蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

各組大鼠mPAP與α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r分別為0.7424和0.7206，P<0.01)，mPAP與CD31 mRNA和蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r分別為-0.6388和-0.7956，P<0.01)；WA/TA與α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r分別為0.7909和0.7567，P<0.01)，WA/TA(%)與CD31 mRNA和蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r分別為-0.8107和-0.8029，P<0.01)；LA/TA與α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r分別為-0.7572和-0.8462，P<0.01)，LA/TA與CD31 mRNA和蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r分別為0.8097和0.8464，P<0.01)；同時(shí)，α-SMA 與TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r分別為0.5614和0.7510，P<0.01)；CD31 與TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r分別為-0.5481和-0.7141，P<0.01)；TGF-β1與Smad2/3 mRNA和蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r分別為0.7495和0.7925，P<0.01)。

討　　論

肺動(dòng)脈高壓是一種以肺動(dòng)脈壓力進(jìn)行性升高為特征的危及生命的疾病，其病理變化包括肺血管收縮和重構(gòu)及平滑肌細(xì)胞抗凋亡性等[12]。缺氧在PAH的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，它能引起肺纖維化并導(dǎo)致PAH[13]。由于PAH發(fā)生同時(shí)往往伴隨著肺泡和血液中二氧化碳分壓升高，因此，制備吸入混合氣體的肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型更符合肺心病人群發(fā)病的情況[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，EndoMT在胚胎發(fā)育時(shí)期心血管系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，是近年來心肌纖維化和腎纖維化等纖維化疾病的研究熱點(diǎn)[16]。體外實(shí)驗(yàn)表明，在低氧情況下，肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞通過EndoMT轉(zhuǎn)分化成平滑肌細(xì)胞，且應(yīng)用EndoMT抑制劑如SB431542能有效減緩內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[17]。但EndoMT是否參與低氧高二氧化碳誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓目前尚未報(bào)道。

EndoMT是內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)、表型及功能的改變，即特異性內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)等表達(dá)減弱或喪失，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1)等增多[18]。EndoMT是一種新認(rèn)可的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化類型，PAH的發(fā)病機(jī)制中起重要作用可能是一種肌成纖維細(xì)胞來源的細(xì)胞，因此抑制EndoMT可能是治療PAH的新型靶點(diǎn)[19]。TGF-β/Smads通路與EndoMT的發(fā)生緊密相關(guān)，TGF-β配體首先與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的TGF-βⅡ型受體(TGF-β receptor Ⅱ，TβRⅡ)結(jié)合，通過TβRⅡ激酶使TβRI磷酸化，并與其共同形成異二聚體或者四聚體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而磷酸化其下游Smad蛋白家族中的受體激活型 Smad2和Smad3，隨后Smad2/3與通用型Smad4形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，激活或者抑制核內(nèi)靶因子轉(zhuǎn)錄[20]，調(diào)控EndoMT發(fā)生。近年來，有研究表明，低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展與血管重塑有關(guān)，并伴隨著肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[21]，其中TGF-β1是促炎因子，也是能促進(jìn)血管重塑和血管收縮的生長(zhǎng)因子，因而是調(diào)控EndoMT的關(guān)鍵細(xì)胞因子，目前已被公認(rèn)是COPD和PAH等炎癥性肺病發(fā)病的重要因子[22-23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與N組比，HH組和各給藥組肺動(dòng)脈平均壓和右心室肥大指數(shù)均顯示不同程度升高，表明低氧高二氧化碳誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈大鼠模型成功復(fù)制。同時(shí)，光鏡下觀察到HH組和各給藥組肺動(dòng)脈中膜亦有不同程度的增生，血管壁增厚明顯；免疫熒光結(jié)果顯示HH組和各給藥組內(nèi)皮細(xì)胞減少或脫落明顯，而平滑肌細(xì)胞呈增生趨勢(shì)，且mPAP、RV/(LV+S)和WA/TA(%)分別與α-SMA呈顯著正相關(guān)，LA/TA(%)與α-SMA呈顯著負(fù)相關(guān)，而mPAP、RV/(LV+S)和WA/TA(%)分別與CD31呈顯著負(fù)相關(guān)，LA/TA(%)與CD31呈顯著正相關(guān)；α-SMA、TGF-β1和p-Smad2/3的mRNA和蛋白表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，而CD31 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，說明低氧高二氧化碳能通過TGF-β1信號(hào)通路引起EndoMT，并造成一定程度的肺血管重構(gòu)，從而產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓。

現(xiàn)代西醫(yī)治療雖然明顯改善了PAH患者的生理功能，但其死亡率仍高達(dá)50%。國(guó)內(nèi)許多學(xué)者根據(jù)低氧性肺動(dòng)脈高壓癥的基本病機(jī)，采用益氣溫陽活血化痰方治療肺動(dòng)脈高壓癥，能夠明顯改善患者缺氧狀況、臨床癥狀并提高生活質(zhì)量[24]，其療效可能與調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)的水平有關(guān)。YWHHF全方組成主要有：黃芪 30 g、人參20 g、附片9 g、川芎10 g、丹參10 g、法夏9 g、薤白12 g和白芥子15 g。方中黃芪能補(bǔ)一身之氣，兼有升陽，固表止汗，排膿生肌，利水消腫的作用，能有效抑制肺纖維化和腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，去除氧自由基[25]；人參含有多種皂甙，揮發(fā)油和多糖類等成分，具有補(bǔ)益強(qiáng)壯和強(qiáng)心等作用，為補(bǔ)肺之要藥[26]；附片和薤白是大溫?zé)嶂?，有回陽救逆、溫腎助陽、祛寒止痛的功效，用于腎陽 不足、畏寒肢冷和風(fēng)寒濕痹等癥；川芎和丹參，為血中之氣藥，具有辛散、解郁、通達(dá)和止痛等功能；法夏和白芥子溫肺化痰，通絡(luò)止痛，諸藥配合具有益氣溫肺、活血化痰和開胸通達(dá)之效[27-28]。但其是否對(duì)低氧高二氧化碳引起的肺動(dòng)脈高壓有干預(yù)作用及其具體機(jī)制目前尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與HH組比，YH、YM和YL組的肺動(dòng)脈平均壓和右心室肥大指數(shù)呈降低趨勢(shì)；HE染色和免疫熒光結(jié)果顯示肺血管壁增厚減少，損傷減輕。同時(shí)，應(yīng)用YWHHF后，原本在低氧高二氧化碳情況下增高的α-SMA、TGF-β1和p-Smad2/3的mRNA和蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，而原本降低的CD31 mRNA和蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)，其中α-SMA、TGF-β1和p-Smad2/3的含量變化呈顯著正相關(guān)，而CD31與TGF-β1的含量變化呈顯著負(fù)相關(guān)，說明YWHHF能有效抑制EndoMT，一定程度上逆轉(zhuǎn)低氧高二氧化碳誘導(dǎo)的肺血管重構(gòu)，從而減低肺動(dòng)脈壓力，其機(jī)制可能與通過抑制TGF-β1及下游信號(hào)通路Smad2/3有關(guān)。綜合藥效、經(jīng)濟(jì)等各方面考慮，中劑量的YWHHF更具有推廣意義。

綜上所述，低氧高二氧化碳誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型中，EndoMT可能通過TGF-β/Smads通路的過度活化而發(fā)生；益氣溫陽活血化痰方可通過抑制TGF-β/Smads通路在一定程度上緩解肺動(dòng)脈高壓。

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