練飛鴻，饒　芳，鄺素娟，陳肖燕，楊　慧，吳飛龍，張夢珍，麥麗萍，林秋雄，單志新，楊　敏，鄧春玉1,△

(1華南理工大學醫(yī)學院，廣東 廣州 510006； 2廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究部，廣東省醫(yī)學科學院，廣東 廣州 510080)

糖尿病的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈逐年上升的狀態(tài)。我國糖尿病的發(fā)病人數(shù)高達9 240萬人，另有約1億4 820萬的成年人處于糖尿病前期狀態(tài)[1]。糖尿病患者的長期高血糖狀態(tài)使得身體各組織和器官都受到嚴重影響，糖尿病是冠心病、房顫和心力衰竭等心血管疾病的主要危險因素[2]，使患者死亡率明顯增高。

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者的一種獨特的心肌病，表現(xiàn)為與高血壓、冠心病、瓣膜病和先天性心臟病無關(guān)的心室功能不全。其突出的病理變?yōu)樾募〖毎蚀?、間質(zhì)纖維化及收縮和舒張功能不全。目前關(guān)于糖尿病是如何導致心肌細胞肥大，進而進展為糖尿病心肌病的機制研究，包括晚期糖基化終末期產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)增加，血管周圍和肌纖維間的纖維化、炎癥反應增強、自噬和細胞凋亡的增加、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活、脂質(zhì)的堆積、鈣調(diào)控紊亂、線粒體功能異常、胰島素抵抗和氧化應激的增強等等[3-4]。在一系列研究中都能反復觀察到糖尿病可以影響嚙齒類動物模型心臟的電復蘇，具體表現(xiàn)為心肌細胞的動作電位延長和QT間期延長等電生理改變[5-6]。這普遍被認為是心肌細胞內(nèi)鈣調(diào)控異常和興奮收縮偶聯(lián)異常所致。因此，進一步明確心肌細胞對高血糖狀態(tài)的復雜的電生理適應機制，對了解糖尿病是如何導致心肌細胞肥大的有著重要意義。

本研究將以自發(fā)性2型糖尿病大鼠作為2型糖尿病模型，探討糖尿病引起的鈣調(diào)控紊亂對心肌細胞肥大的影響。

材　料　和　方　法

1　實驗動物與飼養(yǎng)環(huán)境

SPF級，7周齡雄性Zucker糖尿病肥胖(Zucker diabetic fatty，ZDF；fa/fa)大鼠和Zucker lean (ZL；fa/+)大鼠各15只購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK(高)2012-0001，飼養(yǎng)于中山大學北校區(qū)動物中心，恒溫(22±2) ℃，恒濕(55±5)%，人工光照明暗各12 h/d，噪聲<50 dB，24 h自由取食和飲水。本研究所有動物實驗已通過廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學科學院)的動物實驗倫理審查(No.GDREC201208A)。

2　試劑與儀器

抗β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)、心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)和GAPDH抗體(Cell Signaling Technology)；抗CaV1.2抗體(Alomone Labs)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(Invitrogen)；封閉牛奶和loading buffer(Bio-Rad)；PVDF膜(Millipore)；麥胚凝集素(wheat germ agglutinin，WGA)瓊脂糖(Vector Laboratories); Advatage血糖儀和血糖試紙(Roche)。Vevo 2100彩色多普勒小動物超聲診斷儀(Visual Sonic)。

3　主要方法

3.12型糖尿病動物模型的建立按不同的基因型分為2組，ZDF組大鼠共15只予以Purina 5008飼料(蛋白質(zhì)23.75%、總脂肪7.55%、粗纖維4.00%和消化能14.6 kJ/kg)喂養(yǎng)作為模型組；ZL大鼠予以普通飼料喂養(yǎng)作為對照組。大鼠飼養(yǎng)1周后，使用羅氏血糖檢測試紙和血糖儀，通過尾靜脈采血法定期對2組大鼠進行血糖的測量，利用電子天平測量大鼠的體重值。之后分別在9、10、12、14、16、18和22周齡對2組大鼠的血糖和體重進行測量。

3.2大鼠心功能的測定在ZDF大鼠18周齡時進行超聲心動圖檢測。大鼠取左側(cè)臥位，使用異氟烷麻醉同時持續(xù)低流量給氧，使其保持輕度鎮(zhèn)靜狀態(tài)(異氟烷濃度為3.0%，氧流量為1 L/min)。選用21 MHz高頻探頭，換取胸骨旁短軸左心室乳頭肌水平切面圖像，記錄3個完整心動周期的二維圖像。每只大鼠各取3個心動周期的平均數(shù)值為其所得的檢測值。檢測指標包括左室前壁舒張末期厚度(left ventricular end-diastolic anterior wall thickness，LVAWd)、左室前壁收縮末期厚度(left ventricular end-systolic anterior wall thickness，LVAWs)、左室后壁舒張末期厚度(left ventricular end-diastolic posterior wall thickness，LVPWd)、左室后壁收縮末期厚度(left ventricular end-systolic posterior wall thickness，LVPWs)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic internal dimension，LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic internal dimension，LVIDd)、左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)、左室舒張期容積(left ventricular diastolic volume，LVd)和左室收縮期容積(left ventricular systolic volume，LVs)。

3.3心臟組織WGA染色和細胞表面積計算采用頸椎脫臼法處死大鼠，后取心室組織用PBS沖洗，4%甲醛固定24 h，脫水石蠟包埋切片。常規(guī)脫蠟水合，室溫下用PBS孵育水化后滴加胰酶工作液50 μL，37 ℃濕盒孵育15 min，PBS漂洗終止消化，滴加WGA-AF488工作液(1∶100稀釋)，避光孵育2 h，PBS漂洗和封固劑封片，光學顯微鏡下拍照。應用Image-Pro Plus 6.0軟件以400倍標尺為標準，選取合適的視野，測量出視野內(nèi)組織的面積及總細胞核的總數(shù)，得出單個細胞面積(mm2)=組織面積(mm2)/細胞核總數(shù)。

3.4Western blot 檢測相關(guān)蛋白的表達量的變化用研磨棒對心肌組織研磨、離心、去沉淀后，使用含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液提取心肌細胞的總蛋白，利用BCA法測定蛋白濃度。將各樣品配至終濃度為1 g/L，加入4×SDS上樣緩沖液，沸水水浴10 min，使蛋白質(zhì)變性。SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉常溫緩慢搖蕩1 h封閉。將NC膜放入雜交袋中，加入足量稀釋的 I 抗，置于4 ℃搖床孵育過夜；TBST洗膜，常溫下3次，每次10 min。根據(jù) I 抗來源選擇合適 II 抗(辣根過氧化物酶標記的抗小鼠和抗兔的 II 抗)，以1∶1 000比例稀釋于5% 脫脂奶粉中，常溫輕搖1 h；TBST洗膜，常溫下3次，每次10 min。用ECL試劑盒顯影蛋白條帶，ImageJ圖像分析軟件定量分析目的蛋白及內(nèi)參照β-actin的灰度值，算出比值進行統(tǒng)計分析。

4　統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)方式表示，采用t檢驗進行2組間比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

1　2型糖尿病大鼠模型建立

將7周齡ZL和ZDF大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，ZDF大鼠改為Purina 5008飼料喂養(yǎng)。在10周齡后，ZDF組大鼠血糖和體重均顯著高于ZL組(P<0.01)。

2　超聲心動圖檢測ZDF大鼠心功能的變化

M型超聲心動圖檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2組大鼠的心臟結(jié)構(gòu)和心功能均存在顯著差異，見圖1。與ZL大鼠相比，ZDF大鼠的LVAWd、LVAWs、LVPWd和LVPWs顯著增加(P<0.05或P<0.01)，而LVIDs和LVIDd與對照組相比明顯縮小(P<0.05)，提示左心室肥厚。在心功能方面，ZDF大鼠的LVEF和LVFS顯著升高(P<0.05)，提示ZDF組大鼠出現(xiàn)心功能代償性增強現(xiàn)象，見表1。

Figure 1.The images of M-mode echocardiography for the 18-week-old ZDF and ZL rats.
圖118周齡ZDF大鼠與ZL大鼠的M型超聲心動圖譜

表118周齡ZDF大鼠心臟功能的變化
Table 1.Echocardiographic parameters obtained from the 18-week-old ZDF and ZL rats (Mean±SD.n=15)

IndexZLZDFLVAWd(mm)1．54±0．172．11±0．26?LVAWs(mm)2．22±0．203．14±0．28?LVIDd(mm)8．09±0．887．13±0．49?LVIDs(mm)5．65±0．774．44±0．50?LVd(μL)334．27±52．43268．10±41．66?LVs(μL)157．25±33．4091．20±24．87?LVEF(%)55．73±5．4766．34±5．09?LVFS(%)32．26±3．5138．76±2．37?LVPWd(mm)1．74±0．322．15±0．32??LVPWs(mm)2．42±0．313．02±0．29?

*P<0.05,**P<0.01vsZL group.

3　ZDF大鼠左心室心肌細胞表面積明顯增加

WGA染色結(jié)果顯示，ZDF大鼠與ZL大鼠相比，心肌細胞表面積明顯增加(P<0.05)，提示出現(xiàn)心肌細胞肥厚，見圖2。

4　ZDF大鼠心肌細胞肥大相關(guān)蛋白β-MHC和ANP表達的變化

利用Western blot檢測心肌細胞肥大相關(guān)標志蛋白β-MHC和ANP。結(jié)果顯示，與對照組ZL大鼠相比，ZDF大鼠心臟組織中的β-MHC和ANP的蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖3。

5　ZDF大鼠RAGE以及鈣調(diào)控相關(guān)蛋白CaV1.2和Orai1表達的變化

ZDF組大鼠的RAGE表達與對照組相比明顯升高(P<0.05)，見圖4。在有關(guān)維持鈣穩(wěn)態(tài)的鈣離子通道表達上，與對照組大鼠相比，ZDF 組的CaV1.2表達下降，Orai1表達升高(P<0.05)，見圖5。

Figure 2.Immunofluorescence staining (WGA staining) showed the size of cardiomyocytes in the left ventricle of 18-week-old ZL and ZDF rats (×400).Mean±SD.n=6.*P<0.05vsZL group.
圖2WGA染色顯示ZDF大鼠左心室肌細胞表面積增大

Figure 3.The protein expression of β-MHC and ANP in the ZDF rats.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsZL group.
圖3ZDF大鼠β-MHC和ANP蛋白的表達量增加

Figure 4.The protein expression of RAGE in the ZDF rats.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsZL group.
圖4ZDF大鼠RAGE蛋白的表達增加

討　　論

1　2型糖尿病模型的建立及心功能的變化

良好的糖尿病動物模型能夠更好地模擬疾病在人體的發(fā)生發(fā)展過程。ZDF大鼠是由遺傳性肥胖基因突變導致胰島素抵抗、進一步引起葡萄糖耐量受損的2型糖尿病模型，其特征為肥胖、高血糖、高脂血癥、高胰島素血癥和胰島素抵抗等[7-8]，與人類2型糖尿病發(fā)病情況非常相似。此外，在ZDF大鼠中與疾病相關(guān)的預測蛋白酶活性與人類心血管疾病的預測活動有較高的相似性[9]。所以ZDF大鼠是目前用于研究2型糖尿病及相關(guān)心血管疾病并發(fā)癥的理想模型。我們在實驗中觀察到ZDF大鼠在經(jīng)過Purina 5008飼料飼養(yǎng)后，在10周齡出現(xiàn)了隨機血糖顯著升高，提示ZDF組大鼠出現(xiàn)了2型糖尿病。此外，在18周齡時超聲心動圖顯示ZDF組大鼠的左室前壁和后壁均出現(xiàn)明顯肥厚，心室腔縮小，其FS與EF值代償性增高。WGA染色顯示模型組大鼠的心室肌細胞普遍肥大，且心肌組織中的ANP和β-MHC蛋白表達明顯上調(diào)。上述結(jié)果顯示，在長期持續(xù)的高血糖狀態(tài)刺激下，ZDF鼠出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)和舒張功能障礙，這種情況與臨床上的射血分數(shù)保留的糖尿病病人的心功能改變相似。

Figure 5.The protein expression of CaV1.2 and Orai1 in the ZDF rats.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsZL group.
圖5ZDF大鼠CaV1.2和Orai1蛋白表達的變化

2　AGEs參與了2型糖尿病導致細胞肥大的過程

晚期糖基化終末產(chǎn)物是過量的糖和蛋白質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物，糖尿病狀態(tài)下過量的糖和蛋白質(zhì)在體內(nèi)合成AGEs，AGEs可與人體各種組織蛋白相結(jié)合并破壞這些組織蛋白，使組織膠原降解的能力受損，從而增加纖維化，最終導致心肌僵硬度增加和心臟舒張功能受損[10]。AGEs也通過與RAGE結(jié)合發(fā)揮其活性。糖尿病患者心臟組織中，AGEs和RAGE增加，可激活核因子κB信號通路，使β-MHC表達增加[11]，進而引起心肌細胞肥厚。我們的實驗中也證實，ZDF組大鼠的RAGE表達較對照組相比顯著增加，同時其肥大相關(guān)標志物β-MHC和ANP亦顯著增加，且ZDF大鼠的心室明顯肥厚，并出現(xiàn)舒張功能不全和心功能代償性增強。因此，糖尿病狀態(tài)下AGEs/RAGE軸增強可能參與了心肌細胞肥大，進而導致DCM。

3　糖尿病導致心肌細胞內(nèi)Ca2+調(diào)控紊亂可能是心肌肥厚的重要因素

心肌細胞的鈣調(diào)控過程是細胞的興奮收縮偶聯(lián)過程中細胞內(nèi)鈣離子的波動。當心肌細胞興奮時，心肌L-型鈣通道介導Ca2+內(nèi)流，激活肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+的釋放，引起心肌細胞收縮；細胞舒張時，是由細胞膜鈣泵和鈉鈣轉(zhuǎn)運體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上鈣泵將胞質(zhì)內(nèi)鈣離子排出，這是經(jīng)典的鈣調(diào)控過程。有研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可使心肌細胞的動作電位延長，并隨著時間的推移逐漸出現(xiàn)心功能不全。而高血糖對心肌細胞鈣調(diào)控的干擾可能是導致心肌細胞動作電位延長的重要原因。另有研究顯示持續(xù)高血糖可通過減少鈣離子從L型鈣通道的流入、影響肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放、減慢鈣再攝取的速度、使鈣外流增加，從而改變心肌細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[12]。我們對2組大鼠心室組織的L型鈣通道蛋白表達檢測也發(fā)現(xiàn)，ZDF組大鼠的CaV1.2的蛋白表達是顯著下降的。這與Meo等[13]在利用鏈脲霉素誘導的糖尿小鼠模型上檢測到心肌細胞L型鈣電流減少的結(jié)果相一致。除了傳統(tǒng)的L型鈣通道以外，目前普遍認為Oria1介導的鈣庫操縱性鈣通道也參與了心肌細胞的鈣調(diào)控。在糖尿病模型中，不管是心肌細胞還是平滑肌細胞的Orai1表達都是升高的[14-15]。我們的實驗結(jié)果也顯示，ZDF組大鼠心肌細胞的Orai1表達相對于對照組是明顯升高的。Orai1的表達增高可介導SOCE通道的鈣電流內(nèi)流增加從而參與心肌細胞的鈣調(diào)控，而這可能是由于高血糖通過激活鈣調(diào)磷酸酶/NFATc3信號通路的結(jié)果[15]。在L型鈣通道鈣內(nèi)流減少的情況下，細胞內(nèi)鈣依然存在著鈣超載的表現(xiàn)，除了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵作用的減弱以外，經(jīng)Oria1介導的SOCE通道的鈣離子內(nèi)流增加可能起著重要的作用。這或許是細胞的一個代償性機制，但其引起的鈣超載或許進一步導致了細胞肥大相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，從而促進心肌的肥厚的發(fā)生。

高血糖導致心功能改變和心肌細胞肥大的機制很復雜，鈣調(diào)控紊亂和AGEs/RAGE軸的增強無疑起著重要作用，與其它影響因素之間相互又存在著關(guān)聯(lián)作用，進一步導致了糖尿病心肌病的形成。而進一步的研究有助于闡明這些機制形成和發(fā)展，理清其上下游的關(guān)系是保護糖尿病心臟的一個不可或缺的環(huán)節(jié)。

[參考文獻]

[1]Yang SH,Dou KF,Song WJ.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].N Engl J Med，2010，362(25):2425-2426.

[2]Mozaffarian D,Benjamin EJ,Go AS,et al.Heart disease and stroke statistics-2016 update:a report from the American Heart Association[J].Circulation，2016，133(4):e38-e360.

[3]Bugger H,Abel ED.Molecular mechanisms of diabetic cardiomyopathy[J].Diabetologia,2014,57(4):660-671.

[4]胡波,張曉剛,曾琳琳.糖基化終產(chǎn)物誘導心肌細胞炎癥反應的研究[J].中國病理生理雜志,2007,23(12):2341-2345.

[5]Gruden G,Giunti S,Barutta F,et al.QTc interval prolongation is independently associated with severe hypoglycemic attacks in type 1 diabetes from the EURODIAB IDDM complications study[J].Diabetes Care,2012,35(1):125-127.

[6]李健,劉彤,李廣平.糖尿病心肌離子通道重構(gòu)的研究進展[J].中國病理生理雜志,2012,28(4):751-754,759.

[7]Tikellis C,Wookey PJ,Candido R,et al.Improved islet morphology after blockade of the renin-angiotensin system in the ZDF rat[J].Diabetes，2004，53(4):989-997.

[8]Pamarthi MF,Rudd MA,Bukoski RD.Normal perivascular sensory dilator nerve function in arteries of Zucker diabetic fatty rats[J].Am J Hypertens，2002，15(4 Pt 1):310-315.

[9]Siwy J,Zoja C,Klein J,et al.Evaluation of the Zucker diabetic fatty (ZDF) rat as a model for human disease based on urinary peptidomic profiles[J].PLoS One，2012，7(12):e51334.

[10] Norton GR,Candy G,Woodiwiss AJ.Aminoguanidine prevents the decreased myocardial compliance produced by streptozotocin-induced diabetes mellitus in rats[J].Circulation，1996，93(10):1905-1912.

[11] Aragno M,Mastrocola R,Medana C,et al.Oxidative stress-dependent impairment of cardiac-specific transcription factors in experimental diabetes[J].Endocrinology，2006，147(12):5967-5974.

[12] Pereira L,Matthes J,Schuster I,et al.Mechanisms of [Ca2+]itransient decrease in cardiomyopathy ofdb/dbtype 2 diabetic mice[J].Diabetes，2006，55(3):608-615.

[13] Meo M,Meste O,Signore S,et al.Reduction in Kv current enhances the temporal dispersion of the action potential in diabetic myocytes:insights from a novel repolarization algorithm[J].J Am Heart Assoc，2016，5(2)：e003078.

[14] Sung HH,Kam SC,Lee JH,et al.Molecular and functional characterization of ORAI and STIM in human corporeal smooth muscle cells and effects of the transfer of their dominant-negative mutant genes into diabetic rats[J].J Urol，2012，187(5):1903-1910.

[15] Daskoulidou N,Zeng B,Berglund LM,et al.High glucose enhances store-operated calcium entry by upregula-ting ORAI/STIM via calcineurin-NFAT signalling[J].J Mol Med (Berl)，2015，93(5)：511-521.