王　依，詹　蓉，高建生，張冬英，劉　華

(廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院干?？疲瑥V東 廣州 510080)

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率，不僅病理過程復雜，且目前傳統(tǒng)的放化療及手術治療效果并不理想[1]。因此探討其發(fā)生發(fā)展的相關機制及作用靶點對于控制病情以及個性化診療具有非常重要的意義。隨著對肺癌基因組學研究的不斷深入，微小RNA(microRNA，miRNA，miR)在其中的作用越來越受到研究者的重視。在肺癌的發(fā)生發(fā)展進程中，眾多miRNAs發(fā)揮著類似抑癌或原癌基因樣的作用，調(diào)控肺癌細胞的多種生物學行為[2-3]。miR-195屬于miRNA-15/16/195家族，定位于人染色體17p13.1，在多種腫瘤中可通過靶向不同的基因發(fā)揮抑癌作用[4-5]。Shuang等[6]在喉癌組織及細胞中檢測到miR-195低表達，此外miR-195還可靶向bcl-2基因抑制喉癌細胞Hep-2的增殖并促進其凋亡。在宮頸癌中miR-195可通過調(diào)控HDGF基因抑制腫瘤的生長[7]。Su等[8]通過對100例非小細胞肺癌患者和100健康志愿者的對比分析發(fā)現(xiàn)，miR-195在肺癌中低表達，卻與肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分級密切相關。此外，Gao等[9]在肺癌中研究HMGA2基因的功能時，發(fā)現(xiàn)miR-195可直接調(diào)控HMGA2基因的表達，進而影響H1299細胞的增殖及遷移?？紤]到miRNAs作用的復雜性及靶基因的多樣性，本研究通過轉(zhuǎn)染miR-195 mimics，檢測miR-195對肺腺癌A549細胞惡性生物學行為的影響，并預測其可能的靶基因。

材　料　和　方　法

1　材料與試劑

人肺癌細胞系A549為本實驗室自行凍存。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、RPMI-1640和Opti-MEM培養(yǎng)基購于Gibco；配套轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen； 抗cyclin D1、CDK2、Bcl-2、p-Rb/Rb及β-actin抗體購于Cell Signaling Technology；CCK-8細胞活力分析試劑盒購于廣州奕源生物公司；細胞周期檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、BCA試劑盒和Western blot套裝試劑盒均購于南京凱基公司；miR-195 mimics及陰性對照miRNA(miR-negative control)、MYB基因過表達載體pcDNA3-MYB及其對照質(zhì)粒pcDNA3、野生型及突變型MYB基因3’UTR-螢光素酶表達載體(WT-3’UTR和MUT-3’UTR)的構建和測序由Promega完成；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2　實驗方法

2.1細胞常規(guī)培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實驗用A549細胞用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2條件下，每天換液1次，3～5 d消化傳代。消化后的細胞接種于6孔板中，至細胞生長80%融合時，更換無血清培養(yǎng)基饑餓處理6 h。分別設置空白對照組(control組)、陰性對照(miR-negative control)組(NC組)和轉(zhuǎn)染miR-195 mimics組(miR-195組)。依據(jù)轉(zhuǎn)染說明書，將miR-195 mimics和miR-negative control轉(zhuǎn)染到相應組別的細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。檢驗轉(zhuǎn)染效率后，進行后續(xù)的實驗分析。

2.2CCK-8法測定細胞活力按照說明書，使用CCK-8細胞活力分析試劑盒鑒定各組細胞的細胞活力。經(jīng)酶標儀測定450 nm波長處各孔的吸光度(A)值。

2.3流式細胞術測定細胞周期收集各組細胞，4 ℃、70%無水乙醇避光固定細胞24 h，重懸細胞。依據(jù)細胞周期試劑盒說明書要求，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液孵育30 min，用流式細胞儀檢測激發(fā)光Ex=488 nm處的熒光強度。

2.4Annexin V /PI 雙染色法測定細胞凋亡收集各組細胞，依據(jù)Annexin V /PI 雙染凋亡試劑盒說明書，加入Annexin V-FITC和PI染色液避光孵育30 min。經(jīng)流式細胞儀檢測激發(fā)光Ex=488 nm和發(fā)射光Em=530 nm處的熒光強度。

2.5Transwell實驗測定細胞遷移采用Transwell小室(24孔板，Transwell小室孔徑8 μm)進行檢查細胞遷移。收集處理后的細胞，無血清培養(yǎng)基同步化12 h，調(diào)整細胞密度為2×108/L。Transwell小室上槽腔接種 2×104個細胞(每個小室100 μL)，小室下槽腔內(nèi)加入600 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用棉簽擦除小室上槽腔細胞，0.1%結晶紫染色5 min，用PBS漂洗3次。正置顯微鏡下隨機拍照。

2.6Western blot測定蛋白的表達裂解細胞，萃取細胞蛋白，經(jīng) BCA試劑盒對所提蛋白定量后，使用Western blot套裝試劑盒進行SDS-PAGE。PVDF膜經(jīng)5%的脫脂牛奶封閉后，依據(jù)抗體說明書要求加入相應比例的 I 抗室溫孵育2 h，再加入對應的 II 抗室溫孵育1 h，暗室顯影。

2.7Real-time PCR依據(jù)Trizol說明書的要求提取細胞中的總RNA，純化并定量后取2 μg總RNA催化合成cDNA，而后依據(jù)說明書要求進行PCR擴增。擴增條件為95 ℃ 15 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。miR-195的表達以U6為內(nèi)參照，MYB的mRNA表達以β-actin為內(nèi)參照?；虻南鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCt法進行分析。miR-195 的正向引物序列為5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACAGAAAT-3’，反向引物序列為5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’； U6的正向引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’； MYB的正向引物序列為5’-GAAGGTCGAACAGGAAGGTTATCT-3’，反向引物序列為5’-GTAACGCTACAGGGTATGGAACA-3’；β-actin的正向引物序列為5’-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3’，反向引物序列為5’-ATCCTTCTGACCCATGCCCACCA-3’。

2.8螢光素酶報告基因檢測本實驗采用雙螢光素酶報告基因分析檢測及驗證miR-195的靶基因。首先用靶基因預測數(shù)據(jù)庫TargetScan、PicTar、miRDB和miRanda對miR-195的靶基因進行預測，挑選預測值較高的靶點MYB基因，并進行驗證。然后構建野生型和突變型MYB基因3’UTR-螢光素酶表達質(zhì)粒(WT-3’UTR和MUT-3’UTR)，將質(zhì)粒和/或miR-195 mimics 轉(zhuǎn)入細胞中(轉(zhuǎn)染方法見2.1)，使用螢光素酶報告基因檢測儀進行Dual-Luciferase Reporter Assay，通過檢測螢光素酶的活性來驗證MYB是否是miR-195的作用靶點。實驗設置空載體(psiCHECK-2)組、野生型MYB基因(WT-3’UTR)和突變型MYB基因(MUT-3’UTR)組。實驗結果以螢火蟲螢光素酶與海腎螢光素酶活性的比值來進行統(tǒng)計學分析。

3　統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)均錄入SPSS 17.0軟件中進行統(tǒng)計學分析。計量資料的結果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。單因素方差分析用于多組計量資料之間的統(tǒng)計學分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

1　miR-195 mimics轉(zhuǎn)染效率檢測

Real-time RCR結果顯示，相較于對照組，轉(zhuǎn)染miR-195 mimics之后，A549細胞miR-195的表達水平明顯升高(P<0.05)，可用于后續(xù)實驗分析，見圖1A。

2　過表達 miR-195對A549細胞活力、凋亡及遷移能力的影響

CCK-8實驗結果顯示，轉(zhuǎn)染miR-195 mimics后，A549細胞的細胞活力顯著低于對照組(P<0.05)，見圖1B。

流式細胞術的結果顯示，與對照組比較，A549細胞轉(zhuǎn)染miR-195 mimics后，G0/G1期細胞所占的百分比增加(P<0.05)，S期細胞所占百分比減少(P<0.05)，說明過表達miR-195可抑制A549細胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換，見圖1C。

與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-195 mimics后，A549細胞的早期凋亡率增加(P<0.05)，表明過表達miR-195可明顯促進肺癌A549細胞的凋亡，見圖1D。

Transwell實驗結果顯示，與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-195 mimics后A549細胞的遷移率減少(P<0.05)，表明過表達miR-195可明顯抑制肺癌A549細胞的遷移能力，見圖1E。

3　過表達 miR-195降低細胞周期與凋亡相關蛋白的水平

Western blot結果顯示，相較于對照組，轉(zhuǎn)染miR-195 mimics后A549細胞中cyclin D1、CDK2、p-Rb及 Bcl-2的蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖2。

4　miR-195靶基因的預測及驗證

首先通過生物信息學的方法預測miR-195的可能靶基因，對常用且權威的靶基因預測數(shù)據(jù)庫TargetScan、PicTar、miRDB和miRanda進行檢索后結合已報道的文獻，得到了預測值較高的靶點MYB。MYB與miR-195的結合位點如圖3A所示。

圖3B顯示A549細胞中轉(zhuǎn)入miR-195 mimics之后，MYB的mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。圖3C顯示，與對照組相比，在WT-3’UTR組轉(zhuǎn)入miR-195 mimics后螢光素酶的活性降低(P<0.05)；而MUT-3’UTR組轉(zhuǎn)入miR-195 mimics并不會抑制螢光素酶的活性，表明miR-195可直接作用于MYB基因的3’UTR區(qū)域來抑制其表達。

5　過表達MYB部分逆轉(zhuǎn)miR-195的作用

同時將miR-195 mimic和pcDNA3-MYB轉(zhuǎn)入A549細胞之后，MYB的表達明顯高于對照組(P<0.05)，見圖4A。生物學行為檢測結果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3-MYB后，細胞活力明顯升高(P<0.05，圖4B)；早期凋亡率較對照組降低(P<0.05，圖4C)；遷移率較對照組升高(P<0.05，圖4D)。以上結果表明，MYB過表達可部分逆轉(zhuǎn)miR-195對A549細胞生物學行為的調(diào)控作用。

討　　論

miR-195對不同腫瘤所發(fā)揮的作用亦不盡相同，早期的研究表明，在肺癌中miR-195呈低表達狀態(tài)，可能發(fā)揮抑癌基因樣作用。本研究探討了miR-195對肺腺癌A549細胞生物學行為的調(diào)控作用。CCK-8細胞活力檢測和流式細胞術周期檢測的結果顯示，轉(zhuǎn)染miR-195 mimic后，A549細胞的活力降低，且細胞的周期進程出現(xiàn)明顯的G1/S阻滯；表明miR-195可抑制A549細胞生長。進一步的細胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-195 mimic可促進A549細胞凋亡。此外，Transwell的結果顯示，miR-195可抑制A549細胞的遷移能力，提示miR-195可能通過抑制肺癌A549細胞活力及遷移能力并促進細胞凋亡，抑制肺癌的進一步發(fā)展，進而發(fā)揮抑癌作用。

關于miR-195調(diào)控A549細胞生物學行為的相關機制目前并沒有系統(tǒng)的研究。多數(shù)miRNA在調(diào)控腫瘤細胞增殖及周期時，均涉及到周期相關蛋白表達的變化；Luo等[10]在結腸癌細胞SW480中發(fā)現(xiàn)過表達miR-195可抑制CDK8的表達；此外，在宮頸癌細胞HeLa和C33A中miR-195可調(diào)控cyclinD1a進而影響細胞的周期進程[11]。本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-195 mimic后，A549細胞中周期相關蛋白cyclin D1、CDK2和p-Rb的蛋白水平均顯著降低。Bcl-2則是一種公認的抗凋亡因子[12]，我們的研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-195可抑制A549細胞中Bcl-2的表達，說明miR-195的促凋亡作用可能與調(diào)控Bcl-2的表達相關。由此推測，對周期及凋亡相關因子的影響可能是miR-195調(diào)控A549細胞生物學行為的路徑之一。

Figure 1.The effects of miR-195 on the biological behaviors in the A549 cells.A:detection of the transfection efficiency; B:the effect of miR-195 on the viability in the A549 cells; C:the effect of miR-195 on the cell cycle distribution of A549 cells; D:the effect of miR-195 on the apoptosis of A549 cells; E:the effect of miR-195 on migration ability in the A549 cells (×200).Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.
圖1miR-195對A549細胞生物學行為的影響

Figure 2.The effect of miR-195 over-expression on the expression levels of the cell cycle-and apoptosis-related proteins in the A549 cells.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.
圖2過表達miR-195對A549細胞周期及凋亡相關蛋白表達的影響

Figure 3.Validation ofMYBas a target gene for miR-195.A:miR-195 seed sequence and its complementary binding site in MYB 3’UTR; B:the effect of miR-195 over-expression on the mRNA and protein expression of MYB in the A549 cells; C:the relative luciferase activity in transfected A549 cells.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vspsiCHECK-2 group.
圖3MYB可能是miR-195靶基因的驗證實驗結果

Figure 4.MYBover-expression partially reversed the effects of miR-195.A:the over-expression efficiency of pcDNA3-MYB; B:the effect ofMYBover-expression on the cell viability; C:the effect of MYB over-expression on the apoptosis; D:the effect ofMYBover-expression on the cell migration ability (×200).Mean±SD.n=6.#P<0.05vsmiR-195 mimics+control group.
圖4MYB過表達部分逆轉(zhuǎn)miR-195的作用

眾所周知，miRNAs一般是通過調(diào)控靶基因來實現(xiàn)其功能的[13]，為進一步分析miR-195影響A549細胞生物學行為的分子機制，本實驗對其靶基因進行了預測及驗證。生物信息學分析顯示MYB可能是miR-195的靶基因，且MYB可能與miR-195結合(結合位點如圖3A所示)。對MYB基因進行文獻檢索發(fā)現(xiàn)其是一種直接轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤中高表達，發(fā)揮原癌基因樣作用，并可通過激活Bcl-2和c-Myc等一系列復雜的信號通路網(wǎng)絡調(diào)控細胞的增殖、周期、遷移及凋亡等生物學行為[14-16]。本實驗在A549細胞中同時轉(zhuǎn)入miR-195 mimic和MYB過表達質(zhì)粒對MYB的功能進行了進一步的驗證，結果顯示共轉(zhuǎn)染可部分逆轉(zhuǎn)miR-195對細胞增殖、遷移的抑制作用和其凋亡促進作用，表明MYB是miR-195的靶基因。但是中間涉及的具體機制及信號通路還需進一步深入的研究。

[參考文獻]

[1]Albaba H,Lim C,Leighl NB.Economic considerations in the use of novel targeted therapies for lung cancer:review of current literature[J].Pharmacoeconomics,2017，35(12)：1195-1209.

[2]Yu N,Zhang Q,Liu Q,et al.A meta-analysis:micro-RNAs’ prognostic function in patients with nonsmall cell lung cancer[J].Cancer Med,2017,6(9):2098-2105.

[3]Du X,Zhang J,Wang J,et al.Role of miRNA in lung cancer-potential biomarkers and therapies[J].Curr Pharm Des,2018,23(39)：5997-6010.

[4]He JF,Luo YM,Wan XH,et al.Biogenesis of miRNA-195 and its role in biogenesis,the cell cycle,and apoptosis[J].J Biochem Mol Toxicol,2011,25(6):404-408.

[5]Li Y,Di C,Li W,et al.Oncomirs miRNA-221/222 and tumor suppressors miRNA-199a/195 are crucial miRNAs in liver cancer:a systematic analysis[J].Dig Dis Sci,2016,61(8):2315-2327.

[6]Shuang Y,Li C,Zhou X,et al.Expression of miR-195 in laryngeal squamous cell carcinoma and its effect on proli-feration and apoptosis of Hep-2[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2017,21(14):3232-3238.

[7]Song R,Cong L,Ni G,et al.MicroRNA-195 inhibits the behavior of cervical cancer tumors by directly targeting HDGF[J].Oncol Lett,2017,14(1):767-775.

[8]Su K,Zhang T,Wang Y,et al.Diagnostic and prognostic value of plasma microRNA-195 in patients with non-small cell lung cancer[J].World J Surg Oncol,2016,14(1):224.

[9]Gao X,Dai M,Li Q,et al.HMGA2 regulates lung can-cer proliferation and metastasis[J].Thorac Cancer,2017,8(5):501-510.

[10] Luo Q,Zhang Z,Dai Z,et al.Tumor-suppressive microRNA-195-5p regulates cell growth and inhibits cell cycle by targeting cyclin dependent kinase 8 in colon cancer[J].Am J Transl Res,2016,8(5):2088-2096.

[11] Wang N,Wei H,Yin D,et al.MicroRNA-195 inhibits proliferation of cervical cancer cells by targeting cyclin D1a[J].Tumour Biol,2016,37(4):4711-4720.

[12] Zhu J,Ye Q,Chang L,et al.Upregulation of miR-195 enhances the radiosensitivity of breast cancer cells through the inhibition of Bcl-2[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(6):9142-9148.

[13] Liu B,Li J,Cairns MJ.Identifying miRNAs,targets and functions[J].Brief Bioinform,2014,15(1):1-19.

[14] Zhou C,Chen Y,Wu Z,et al.Genome-wide analysis of theMYBgene family in physic nut (JatrophacurcasL.) [J].Gene,2015,572(1):63-71.

[15] Uttarkar S,Frampton J,Klempnauer KH.Targeting the transcription factor Myb by small-molecule inhibitors[J].Exp Hematol,2017,47:31-35.

[16] Musa J,Aynaud MM,Mirabeau O,et al.MYBL2 (B-Myb):a central regulator of cell proliferation,cell survi-val and differentiation involved in tumorigenesis[J].Cell Death Dis,2017,8(6):e2895.