周　燁，賈海濤，王　通，張　靜

(暨南大學(xué)生命與健康工程研究院，廣東 廣州 510632)

肺癌(lung cancer)是當(dāng)今世界上嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤之一，也是我國(guó)發(fā)病率最高的腫瘤。特別是近年來(lái)隨著環(huán)境污染的加劇和吸煙人數(shù)的上升，全球每年新診斷出的肺癌病人超過(guò)三分之一都在中國(guó)[1-3]。盡管目前針對(duì)肺癌的手術(shù)、化療與放療等手段已有極大提升，但是對(duì)肺癌的整體治療仍不樂(lè)觀[4]。因此，尋找有效的靶點(diǎn)為肺癌的診斷與治療尋求新的突破口尤為重要。

腫瘤標(biāo)志物廣泛用于肺癌的輔助診斷、療效評(píng)估和預(yù)后判斷等。表皮生長(zhǎng)因子受體 (epidermal growth factor receptor,EGFR) 在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)病人中異?；罨⒄{(diào)控腫瘤細(xì)胞的一系列惡性表型[5]，靶向EGFR酪氨酸激酶抑制劑的藥物，如厄洛替尼和吉非替尼等已用于非小細(xì)胞肺癌的臨床治療[6]。此外，靶向人類表皮生長(zhǎng)因子受體2 (human epidermal growth factor receptor,HER-2)、第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因 (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN) 及核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB) 等經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)研究也取得顯著成果[7-9]。但因腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性及臨床特點(diǎn)的復(fù)雜性等因素制約，仍需開發(fā)理想的腫瘤標(biāo)志物以探明肺癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)，為降低肺癌的發(fā)病率及促進(jìn)治愈帶來(lái)新的希望。

Bcl-2相關(guān)抗凋亡基因2(Bcl-2-associated athanogene 2,BAG2) 是BAG基因家族中的一員，目前已知該家族共有6個(gè)成員 (BAG1～6)，它們的共同特點(diǎn)是C末端都含有一段相同的BAG結(jié)構(gòu)域序列[10]。BAG家族蛋白是多功能結(jié)合蛋白，可與許多蛋白相互作用，調(diào)節(jié)各種生物化學(xué)反應(yīng)，包括蛋白激酶的活性、轉(zhuǎn)錄因子活性和受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，進(jìn)而影響細(xì)胞的分裂、凋亡、遷移和分化[11]。在腫瘤相關(guān)研究領(lǐng)域中，Yue 等[12]發(fā)現(xiàn)BAG2可以通過(guò)促進(jìn)突變p53基因在癌細(xì)胞中累積，并與多種不同突變形式的p53相互作用，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)BAG2來(lái)抵御蛋白酶抑制劑引起的細(xì)胞凋亡。而Li[14]等通過(guò)對(duì)29例肺腺癌及癌旁組織中BAG基因家族表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，BAG2在癌旁組織中的表達(dá)量高于癌組織，為肺腺癌發(fā)生的保護(hù)性因素。目前關(guān)于BAG家族基因在腫瘤中的具體作用及機(jī)制還存在爭(zhēng)議，尤其關(guān)于BAG2基因與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系還有待進(jìn)一步探究。

我們前期對(duì)人肺腺癌 A549 細(xì)胞和正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE的各亞組開展了的比較蛋白組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)BAG2蛋白在A549中高表達(dá)[15]。因此，本研究中我們對(duì)BAG2蛋白在A549細(xì)胞增殖中所扮演的角色，及其對(duì)肺癌患者預(yù)后的可能臨床意義開展了進(jìn)一步研究。

材　料　和　方　法

1　細(xì)胞培養(yǎng)

A549及HBE細(xì)胞購(gòu)自ATCC，按照前期實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行培養(yǎng)[15-16]。其中，DMEM完全培養(yǎng)基 (Life Technologies) 為含10%胎牛血清 (Life Technologies) 及1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。

2　Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)依照我們前期的方法進(jìn)行[17-18]。簡(jiǎn)要步驟為：細(xì)胞用RIPA裂解液(碧云天公司)裂解，以BCA法測(cè)定蛋白濃度。細(xì)胞上樣樣本用10% SDS-PAGE進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)PVDF膜、封閉、抗體孵育和顯影。所用Ⅰ抗分別為：兔抗人BAG2多克隆抗體(Abcam)、兔抗人cyclin B1、cyclin E1多克隆抗體(Santa Cruz)和鼠抗人β-actin單克隆抗體(Proteintech Group)；所用Ⅱ抗為：辣根過(guò)氧化物酶連接的羊抗兔、羊抗鼠Ⅱ抗(Proteintech Group)。我們利用ImageJ 1.44軟件對(duì)Western blot的結(jié)果進(jìn)行分析，條帶灰度統(tǒng)計(jì)方法按照前期實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行[19]，具體步驟如下：(1)先將圖片轉(zhuǎn)換為8-bit 灰度等級(jí)的格式，然后對(duì)每個(gè)條帶進(jìn)行灰度值讀??；(2)用每次實(shí)驗(yàn)中各自的β-actin 作歸一化處理，以減少背景差異；(3)將對(duì)照組作為1，其余的以比值表示，這樣將灰度值化為比值，得到量化結(jié)果。

3　RNA干擾(RNA interference，RNAi)的效果檢測(cè)

我們合成了BAG2基因的干擾序列和陰性對(duì)照(negative control，NC)的siRNA(上海吉瑪公司設(shè)計(jì))，詳見表1。采用LipofectamineTMRNAiMAX (Invitrogen)將siRNA轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，并篩選出最有效的干擾片段及干擾濃度。此外，采用qPCR來(lái)檢測(cè)BAG2-siRNA干擾片段的干擾效果[20-21]。簡(jiǎn)要步驟為：A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染BAG2-siRNA或NC siRNA 48 h后，分別收集細(xì)胞，利用Trizol提取總RNA。按照High Fidelity PrimeScript RT-PCR Kit(TaKaRa)試劑盒說(shuō)明書的要求將RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板cDNA。其中，基因特異性引物由Invitrogen合成，見表2。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

表1　siRNAs序列Table 1.Sequences of the siRNAs

表2　qPCR引物序列Table 2.Sequences of the qPCR primers

4　CFSE染色法及WST-1法檢測(cè)細(xì)胞增殖

CFSE染色法細(xì)胞增殖檢測(cè)按照我們前期方法進(jìn)行[22]。具體如下：用DMSO充分溶解CFSE粉末，配制5 mmol/L CellTraceTMCFSE儲(chǔ)液。收集A549細(xì)胞，PBS洗2次。用PBS稀釋CFSE儲(chǔ)液為5 μmol/L的工作液。加入CFSE染料于細(xì)胞沉淀中，輕柔吹打均勻，37 ℃孵育10 min，每隔2 min搖晃一下EP管。離心棄上清，PBS洗滌細(xì)胞2次，計(jì)數(shù)后鋪入6孔板，每孔細(xì)胞量約3×105個(gè)。細(xì)胞貼壁后進(jìn)行RNA干擾，待干擾48 h和72 h后，分別收集細(xì)胞做流式檢測(cè)。利用軟件 FlowJo對(duì)細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

WST-1法檢測(cè)細(xì)胞增殖依照前期實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行[23]。大致步驟為：收集干擾12 h后的A549細(xì)胞、離心、計(jì)數(shù)，按照每孔3 000個(gè)種于96孔板，48 h和72 h后去除培養(yǎng)基，分別加入含WST-1的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)2 h，利用酶標(biāo)儀(Bio-Tek)讀取450 nm處的吸光度(A)值。

5　qPCR檢測(cè)肺癌組織中BAG2的表達(dá)

按照我們前期實(shí)驗(yàn)所用qPCR的方法[21]來(lái)檢測(cè)組織中BAG2的表達(dá)情況，大體如下：取10對(duì)肺腺癌及癌旁組織cDNA芯片(cDNA-HLugA030PG01，上海芯超生物科技有限公司)作為模板，引物設(shè)計(jì)如表2所示，以SYBR Green為熒光染料，按照cDNA芯片說(shuō)明書進(jìn)行操作。qPCR的結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

6　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本文用于分析BAG2基因在肺癌組織與癌旁組織表達(dá)量的數(shù)據(jù)發(fā)表于Gene Expression Omnibus (GEO) 數(shù)據(jù)庫(kù)中 (GSE21933[24]和GSE10072[25]) 。 Kaplan-Meier 生存曲線與log-rankPvalues通過(guò)在線網(wǎng)站(http://kmplot.com/analysis/lung)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究其它數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,組間差異比較采用Student’st檢驗(yàn)或Kolmo-gorov-Smirnov (KS)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　BAG2有效干擾片段的篩選

Western blot實(shí)驗(yàn)表明，A549細(xì)胞總蛋白中BAG2表達(dá)量明顯高于HBE細(xì)胞，見圖1A。

我們測(cè)試了3種干擾片段和1種陰性對(duì)照干擾片段對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)BAG2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞在不同的干擾片段(50 nmol/L)作用48 h后，與對(duì)照相比，其BAG2表達(dá)量均發(fā)生明顯下調(diào)，其中BAG2-siRNA 3干擾片段的干擾效果最為顯著，故選取其作為最有效的干擾片段，見圖1B。

進(jìn)而，我們對(duì)干擾片段BAG2-siRNA 3 的最低有效濃度進(jìn)行篩選，分別用 50、100和150 nmol/L的BAG2-siRNA 3干擾A549細(xì)胞48 h，并進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BAG2-siRNA 3 作用濃度為50 nmol/L時(shí)，沉默效果已經(jīng)較強(qiáng)，且隨著濃度的升高，干擾效果并沒(méi)有明顯提高，見圖1C。qPCR驗(yàn)證表明，50 nmol/L的BAG2-siRNA 3作用于A549細(xì)胞48 h后，mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比有顯著降低(P<0.01)，見圖1D。

2　沉默BAG2抑制A549細(xì)胞增殖

為了探索BAG2基因?qū)549細(xì)胞增殖能力的影響，我們對(duì)干擾了BAG2的A549細(xì)胞進(jìn)行CFSE染色。在細(xì)胞分裂增殖過(guò)程中，CFSE標(biāo)記的熒光被平均分配至2個(gè)子代細(xì)胞中，其熒光強(qiáng)度為親代細(xì)胞的一半，因此細(xì)胞增殖越快CFSE熒光強(qiáng)度越弱[26-27]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CFSE熒光強(qiáng)度來(lái)判斷細(xì)胞的增殖情況。我們發(fā)現(xiàn)，干擾48 h后，干擾組與對(duì)照組相比熒光強(qiáng)度增強(qiáng)約20%，而干擾72 h后這種差異更加明顯，熒光強(qiáng)度高約25%。以上結(jié)果表明，A549細(xì)胞干擾BAG2后相較于對(duì)照組細(xì)胞分裂次數(shù)減少，CFSE熒光強(qiáng)度增高，即下調(diào)BAG2可以抑制A549細(xì)胞的增殖，見圖2A。

WST-1也是目前常用于細(xì)胞增殖檢測(cè)的一種類似于MTT的化合物，在電子耦合劑存在時(shí)，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲臜，細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深，在450 nm處的吸光度值越高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證BAG2對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響，我們對(duì)干擾了BAG2的A549細(xì)胞進(jìn)行WST-1實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在干擾48和72 h后，A549的增殖情況發(fā)生均顯著下調(diào)，即BAG2沉默能抑制A549細(xì)胞增殖，見圖2B。

3　干擾BAG2通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白抑制A549細(xì)胞增殖

由于干擾BAG2后A549細(xì)胞增殖受到抑制，我們通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的變化來(lái)探究干擾BAG2基因?qū)?xì)胞周期的影響。 經(jīng)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)BAG2被干擾48 h后，A549細(xì)胞中的細(xì)胞周期蛋白cyclin B1與cyclin E1均發(fā)生顯著下調(diào)。該結(jié)果表明BAG2介導(dǎo)的促細(xì)胞增殖作用可能是通過(guò)cyclin B1與cyclin E1來(lái)實(shí)現(xiàn)的，見圖3。

Figure 1.siRNA-mediated knockdown ofBAG2 gene in A549 cells.Mean±SEM.n=3.#P<0.05vsHBE；*P<0.05，**P<0.01vsNC.
圖1BAG2干擾片段的干擾效果檢測(cè)

Figure 2.Knockdown ofBAG2 gene results in inhibition proliferation of A549 cells.A549 cells were transfected with siRNA againstBAG2 or NC siRNA for 48 h and 72 h,and cells were subjected to CFSE staining analysis (A) and WST-1 assay (B).si-BAG2：BAG2-siRNA 3.Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC.
圖2干擾BAG2可抑制A549細(xì)胞增殖

Figure 3.BAG2 expression is positively correlated with cyclin B1 and cyclin E1.si-BAG2：BAG2-siRNA 3.Mean±SEM.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsNC.
圖3BAG2與A549細(xì)胞中cyclinB1和cyclinE1的表達(dá)呈正相關(guān)

4　BAG2在肺癌臨床病例中高表達(dá)且預(yù)后差

為進(jìn)一步明確BAG2與肺腺癌臨床的相關(guān)性，評(píng)價(jià)其對(duì)肺癌的預(yù)后價(jià)值，我們利用qPCR驗(yàn)證了10對(duì)肺癌及其癌旁組織的cDNA芯片中BAG2的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，肺癌組織中BAG2表達(dá)水平發(fā)生顯著上調(diào)(P<0.01)，見圖4A。此外，我們通過(guò)比較分析GEO數(shù)據(jù)中的兩個(gè)數(shù)據(jù)集(GSE21933[24]，GSE10072[25]) 中BAG2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在肺腺癌組織中的BAG2表達(dá)量顯著高于癌旁組織，見圖4B。通過(guò)Kaplan-Meier 存活曲線分析來(lái)研究BAG2的表達(dá)量與肺腺癌病人整體存活情況(overall survival) 的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)肺腺癌病人中高表達(dá)BAG2的患者在250個(gè)月內(nèi)的存活情況顯著低于BAG2低表達(dá)組(P<0.01)，見圖4C。該結(jié)果表明，高表達(dá)BAG2的病人生存期比相對(duì)低表達(dá)的病人更短，即BAG2高表達(dá)可作為一個(gè)預(yù)測(cè)肺癌不良預(yù)后的新的生物學(xué)指標(biāo)。

討　　論

在我國(guó)，肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，深入研究肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為及其分子機(jī)制，可以對(duì)腫瘤患者進(jìn)行更加準(zhǔn)確的早期診斷及預(yù)后評(píng)估，并找出新的治療靶點(diǎn)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)BAG2蛋白于肺腺癌A549細(xì)胞顯著高表達(dá)，且BAG2基因的高表達(dá)與肺癌患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。表明BAG2可作為肺癌診斷與治療的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。

但是，BAG2基因在不同腫瘤中所扮演的角色不盡相同。例如，有文獻(xiàn)表明BAG2在多種腫瘤組織中高表達(dá)，包括肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等[12]，這與本研究結(jié)果相一致。然而，Li等[14]采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)肺腺癌患者癌組織及癌旁肺組織BAG家族基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BAG2高表達(dá)于癌旁肺組織。這些研究結(jié)果的差異可能與選用病例的疾病分期及組織學(xué)類型不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中Western blot結(jié)果及前期質(zhì)譜數(shù)據(jù)均顯示，BAG2在肺腺癌A549細(xì)胞中高表達(dá)，且BAG2基因可能通過(guò)細(xì)胞周期蛋白cyclin B1與 cyclin E1調(diào)控A549的細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果揭示，敲低A549細(xì)胞的BAG2基因可導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢，且細(xì)胞周期蛋白cyclin B1與 cyclin E1表達(dá)下調(diào)。 細(xì)胞周期蛋白cyclin B1主要在細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，有研究發(fā)現(xiàn)，cyclin B1在部分NSCLC中高表達(dá)，且與不良預(yù)后有關(guān)[28]。Cyclin E1主要在G1/S期起調(diào)節(jié)作用且與中心體的復(fù)制有關(guān)，cyclin E1的異常表達(dá)通常會(huì)引起染色體的不穩(wěn)定[29-30]。Li等[31]發(fā)現(xiàn)通過(guò)下調(diào)周期蛋白cyclin D1和cyclin E的表達(dá)可阻滯細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制人肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9增殖。另有研究也發(fā)現(xiàn)通過(guò)藥物作用下調(diào)cyclin B1、cyclin E1和Cdc2等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白可以抑制NSCLC的生長(zhǎng)[32]。本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)干擾BAG2 48 h后，細(xì)胞周期蛋白cyclin B1及cyclin E1蛋白水平發(fā)生顯著下調(diào)且細(xì)胞增殖受到明顯抑制，表明BAG2可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白cyclin B1及cyclin E1來(lái)影響A549細(xì)胞增殖。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)BAG2在肺癌中傾向于發(fā)揮促癌功能，有作為肺癌進(jìn)展和預(yù)后生物標(biāo)記物的潛能，其促癌的機(jī)制可能與cyclin B1與 cyclin E1相關(guān)。

Figure 4.BAG2 has prognostic value in lung cancer.A:cDNA microarray comparison of BAG2 mRNA expression in lung adenocarcinoma and corresponding normal tissues; B:GEO datasets analysis of BAG2 mRNA expression in lung cancer and normal tissues; C:Kaplan-Meier curves of patients with lung cancer.
圖4BAG2在肺癌進(jìn)展中具預(yù)后潛力

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