穆　碩　羅　潔　楊子彪　肖　晨　?！≤S

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100083；2.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程與經(jīng)管系， 大理 671003；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部北京市共建功能乳品重點實驗室， 北京 100083； 4.河北省畜產(chǎn)食品工程技術(shù)中心， 三河 065200)

0　引言

乳餅是云南少數(shù)民族地區(qū)的一種傳統(tǒng)奶酪制品，具有鮮美的味道和獨特的口感，被稱為“中國奶酪”[1-2]，深受消費者喜愛。目前乳餅的生產(chǎn)大多為手工作坊式生產(chǎn)，工藝落后，沒有現(xiàn)代奶酪加工的凝乳酶，只是采用當?shù)氐孽r青羊參葉作為凝乳劑，制作的乳餅得率低，產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定。

青羊參(CynanchumotophyllumSchneid.)是蘿藦科鵝絨藤屬多年生草質(zhì)藤本植物，分布于云南、四川和西藏、貴州、廣西、湖南等省區(qū)[3]。目前關(guān)于青羊參的研究大多集中在其藥理作用和提取物成分分析[4-5]，青羊參已分離鑒定出來的成分多為青羊參皂苷及其皂苷元素，具有抗癲癇作用。云南少數(shù)民族在長期的生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)了其具有較好的凝乳作用，因此，將其作為制作乳餅的原料。但是凝乳機理尚未闡明，其有效凝乳成分的提取及應(yīng)用條件也未見報道。

作為一種即食型的新鮮奶酪，凝乳的好壞直接影響乳餅的得率、質(zhì)構(gòu)及感官品質(zhì)。傳統(tǒng)乳餅是一種典型的酸熱輔助酶凝奶酪，即將鮮乳(羊乳或牛乳)加熱煮沸后添加前次乳餅制作時排出的酸乳清或食用酸，并輔助添加凝乳劑凝結(jié)成塊，壓榨成型[6]。凝乳時使用的酸乳清多憑經(jīng)驗自然調(diào)制而成，其中微生物、酶系組成復(fù)雜，存在安全隱患，并極易導(dǎo)致污染和產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。除了酸凝乳外，在云南省劍川、鶴慶等縣市，當?shù)厝嗣駥數(shù)靥厣参锴嘌騾⒑拓灲钐俳菀捍娌糠炙崛榍?，利用其中的植物凝乳酶凝乳制作乳餅[7]。由于青羊參和貫筋藤等浸泡液的配制工藝不規(guī)范，凝乳活力差異較大，其添加量也靠經(jīng)驗判斷，沒有統(tǒng)一的標準，難以達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此，制備符合標準化生產(chǎn)的乳餅?zāi)閯┚哂兄匾膽?yīng)用前景。

本文從青羊參提取溫度、液料比及提取液種類入手，優(yōu)化青羊參凝乳劑的提取條件，并將優(yōu)化后提取的凝乳劑進行乳餅的制作，比較該方法與云南傳統(tǒng)加工方法(酸凝和利用青羊參葉浸泡液凝乳)制得的乳餅組分、得率、質(zhì)構(gòu)特性和微觀結(jié)構(gòu)，以期為青羊參凝乳劑的開發(fā)及其在乳餅標準化生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

鮮牛乳：取自北京市沙河春山奶牛廠，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)3.30%，脂肪質(zhì)量分數(shù)3.75%。

青羊參葉：采自云南省大理市劍川縣，由云南大理農(nóng)林職業(yè)學(xué)院提供。自然晾干，放于-20℃冷凍保存。

1.2　主要儀器與設(shè)備

UV-2102 PC型紫外可見分光光度計，上海UNICO公司；Thermo Sorvall LYNX4000型低溫高速離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；UF/UVPL 5124型超純水儀，美國Pall公司；KDY-9830型凱氏定氮儀，北京思貝得機電技術(shù)研究所；TMS Pro型質(zhì)構(gòu)儀，美國Food Technology Corporation公司；A1Rsi型激光共聚焦顯微鏡，日本尼康公司。

1.3　方法

青羊參蛋白酶的提取條件參照王紅燕等[7]的方法并做部分修改，具體如下。

1.3.1青羊參葉子提取溫度

選用4℃、55℃和25℃(室溫)3種溫度研究不同溫度處理對青羊參葉子凝乳效果的影響，實驗方案如下：稱取3份相同質(zhì)量的青羊參葉子，分別于4、25、55℃靜置40 min平衡溫度，后將青羊參干葉子剪碎，以液料比20 mL/g加入pH值6.5的10 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液，混勻后分別于4、25、55℃浸提2 h(每20 min振蕩1 min)，然后用4層紗布過濾去除葉子，濾液于4℃、8 000g離心40 min除雜，上清液用0.22 μm濾膜過濾，微濾液通過10.0 kD超濾管濃縮分離(前期預(yù)實驗結(jié)果得知10.0 kD超濾管效果最好)，取上層截留液獲得青羊參蛋白酶濃縮液，隨后以體積比1∶20分別加入12 g/mL脫脂還原乳(含10 mmol/L CaCl2)混勻后放置于30℃水浴鍋，觀察并記錄形成凝塊所需要的時間即為凝乳時間。

1.3.2青羊參葉子提取液料比

選取10、20、30 mL/g 3種液料比探究其對青羊參葉子蛋白酶提取效果的影響。實驗方案如下：將青羊參干葉子剪碎，分別以液料比10、20、30 mL/g加入pH值6.5的10 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液，混勻于4℃浸提2 h(每20 min振蕩1 min)，然后用4層紗布過濾去除葉子。濾液于4℃、8 000g離心40 min除雜，上清液用0.22 μm濾膜過濾，微濾液通過10.0 kD超濾管濃縮分離。采用考馬斯亮藍法[8]測定濃縮液蛋白含量，并用12 g/mL脫脂還原乳觀察凝乳時間。

1.3.3青羊參葉子提取溶液

選用檸檬酸-磷酸緩沖液和超純水研究不同提取溶液對提取效果的影響。實驗方案如下：將葉子剪碎后，以液料比20 mL/g加入超純水、pH值6.5的10 mmol/L 檸檬酸-磷酸緩沖液(含150 mmol/L NaCl、1 mmol/L Cys和EDTA)，混勻，于4℃浸提2 h(每20 min振蕩1 min)，然后用4層紗布過濾，濾液于4℃、8 000g離心40 min除雜，上清液用0.22 μm濾膜過濾，微濾液通過10.0 kD超濾管濃縮分離，取上層截留液獲得青羊參蛋白酶濃縮液。采用考馬斯亮藍法[8]測定濃縮液蛋白含量，并用12 g/mL脫脂還原乳觀察凝乳時間。

1.3.4凝乳活性測定

凝乳活性鑒定參照BRUTTI等[9]的方法并略做修改。12 g/mL脫脂還原乳(含10 mmol/L CaCl2)1 mL加入0.1 mL酶液混勻后置于37℃條件下，觀察并記錄凝乳時間。一個凝乳活力單位定義為在特定溫度下40 min凝結(jié)1 mL中乳所需酶的量，用索氏單位(U)表示。計算公式為

N=2 400V0/(Vt)

(1)

式中N——凝乳活力

V0——加入底物的體積，mL

V——加入蛋白酶溶液的體積，mL

t——凝乳時間，s

1.3.5青羊參凝乳劑制備

確定以上最優(yōu)提取條件后，在最適溫度下，用選定的提取液以最佳液料比浸提2 h(每20 min振蕩1 min)，然后用4層紗布過濾，濾液于4℃、8 000g離心40 min除雜，上清液用0.22 μm濾膜過濾，微濾液通過10.0 kD超濾管濃縮分離，取上層截留液獲得青羊參凝乳劑，測定其凝乳活力。

1.3.6傳統(tǒng)葉子浸泡液制備

將傳統(tǒng)酸凝制作乳餅時排出的乳清，經(jīng)3 000g離心20 min后，按液料比20 g/mL浸泡青羊參葉子12 h，備用。

1.3.7乳餅制作

3L原料奶經(jīng)過濾雜后于63℃加熱30 min進行巴氏殺菌，升溫至80℃，分別加入50%乳酸、1.5%浸泡液和1.5%青羊參凝乳劑，調(diào)節(jié)pH值至開始凝乳。加入乳酸時要緩慢并保持攪拌，防止局部pH值較高提前出現(xiàn)凝塊。3組凝乳20 min后用8層紗布過濾，并用紗布將凝塊包住，600 kPa擠壓6 h壓制成型。

1.3.8乳餅理化指標測定

采用干燥法(GB 5009.3—2016)測定含水率；采用凱氏定氮法(GB 5009.5—2016)測定蛋白質(zhì)含量；采用羅茲-哥特里法(GB 5009.6—2016)測定脂肪含量。

1.3.9乳餅得率、蛋白質(zhì)回收率和脂肪回收率測定

乳餅得率、蛋白質(zhì)回收率和脂肪回收率計算公式為

Y=Mc/Mr×100%

(2)

Rp=McCp/(MrCrp)×100%

(3)

Rf=McCf/(MrCfr)×100%

(4)

式中Y——乳餅得率，%

Mc——乳餅質(zhì)量，g

Mr——原料乳質(zhì)量

Rp——蛋白質(zhì)回收率，%

Cp——乳餅蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)，%

Crp——原料乳蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)，%

Rf——脂肪回收率，%

Cf——乳餅脂肪質(zhì)量分數(shù)，%

Cfr——原料乳脂肪質(zhì)量分數(shù)，%

1.3.10乳餅質(zhì)構(gòu)特性測定

乳餅質(zhì)構(gòu)測定參照WANG等[10]的TPA質(zhì)構(gòu)分析法，將乳餅樣品切割成1 cm×1 cm×1 cm的小方塊，采用二次下壓法進行測定，具體參數(shù)如下：探頭類型為P/25，測試速度為0.4 mm/s，樣品變形量為30%，觸發(fā)力為0.2 N，2次壓縮間隔時間5 s。

1.3.11乳餅微觀結(jié)構(gòu)測定

參照LOPEZ等[11]的方法：從乳餅樣品切下5 mm×5 mm×2 mm的薄片置于載玻片上。用膠頭滴管吸取1.0 g/L的快綠超純水溶液滴至樣品上，在暗盒中充分染色5 min后用滴管吸取0.1 g/L的尼羅紅乙醇溶液滴至樣品上，在暗盒中繼續(xù)染色5 min。染色完成后用純水從樣品一角緩緩沖洗3遍以洗凈染料，清洗結(jié)束后覆蓋蓋玻片，倒置于顯微鏡下用60倍油鏡觀察。尼羅紅與快綠的激發(fā)波長分別為488 nm與633 nm。調(diào)整至視野清晰后采集圖片。

1.3.12數(shù)據(jù)分析

每組實驗均重復(fù)3次并取平均值。實驗數(shù)據(jù)采用Excel整理和制圖，SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析，各表中數(shù)值以平均值±標準差表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2　結(jié)果與分析

2.1　青羊參蛋白酶提取方法評價

2.1.1溫度處理對提取效果的影響

青羊參葉子在55℃處理40 min后，其所需要的凝乳時間是(110.37±3.48) min，是4℃處理下凝乳時間((15.93±0.67) min)的7倍，結(jié)果表明55℃處理40 min會使青羊參葉子凝乳作用顯著減弱；25℃處理組的凝乳時間是(40.58±1.39) min，是4℃組的3倍。陶亮等[12]在開發(fā)貫筋藤植物凝乳劑時發(fā)現(xiàn)其最佳提取溫度為55℃；但多數(shù)研究表明，較高溫度處理可導(dǎo)致蛋白酶活性降低甚至喪失[13]。AHMED等[14]提取茄屬橙色虎眼新鮮種子中的凝乳酶時發(fā)現(xiàn)最佳提取溫度是4℃。本研究結(jié)果表明，青羊參葉的最佳提取溫度為4℃，為維持青羊參蛋白酶的活性，青羊參在采摘后應(yīng)保存在4℃條件下，且提取過程中需要嚴格控制低溫。

2.1.2液料比對提取效果的影響

液料比是蛋白酶提取條件中的重要因素，一方面液料比升高會增加蛋白酶的溶出效率，另一方面隨著液料比的升高，蛋白酶的濃度會降低，從而影響酶的穩(wěn)定性和活性[15]。GUIAMA等[16]提取茄屬果實中蛋白酶的最佳液料比為10 mL/g；王紅燕等[7]研究貫筋藤莖中凝乳酶的提取工藝發(fā)現(xiàn)其最佳提取的液料比為20 mL/g。在本研究中，液料比10、20、30 mL/g組的凝乳活力分別為(147.7±1.98)U/mg、(213.6±3.42)U/mg、(204.2±2.87)U/mg，20 mL/g組的青羊參蛋白酶濃縮液的凝乳活力最大。

2.1.3提取溶液對提取效果的影響

MAZORRA-MANZANO等[17]從酸橙柑橘的花中提取植物凝乳酶時確定的最佳提取液為pH值6.5的10 mmol/L 檸檬酸-磷酸緩沖液(含150 mmol/L NaCl、1 mmol/L Cys和EDTA)；而在云南傳統(tǒng)乳餅加工中通常使用超純水進行青羊參中酶的提取[6-7]。本研究結(jié)果如表1所示，相比于超純水浸提提取，pH值6.5的10 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液提取得到的蛋白酶溶液凝乳活力較高((213.6±3.42) U/mg)，且蛋白含量高出一倍，這是由于蛋白酶在低鹽溶液中的溶解度高于超純水[18]，用檸檬酸-磷酸緩沖液可以提取更多蛋白酶。因此確定青羊參蛋白酶的提取溶液為檸檬酸-磷酸緩沖液。

表1　不同提取溶液對提取效果的影響Tab.1　Effect of different extraction solutions on Cynanchum otophyllum leaves

注：同列不同字母表示數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

綜合考慮溫度、液料比和提取溶液對提取效果的影響，最終確定蛋白酶提取工藝為：液料比20 mL/g，提取液為pH值6.5的10 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液，浸提溫度為4℃。制備的青羊參蛋白酶凝乳劑凝乳活力為(213.6±3.42) U/mg，顯著高于文獻中報道的植物凝乳酶木瓜蛋白酶的凝乳活力((100.2±1.67) U/mg)，與菠蘿蛋白酶的凝乳活力((222.2±3.21) U/mg)相近[19]。因此，青羊參蛋白酶具備廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景，可用于乳餅的工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2　乳餅的理化指標、回收率及得率

凝乳是乳餅制作中最關(guān)鍵的工藝，顯著影響乳餅的組分和質(zhì)構(gòu)。根據(jù)酪蛋白膠束穩(wěn)定性破壞的原理，凝乳可分為酸凝、酶凝和酸酶共促3種。酸凝是指酪蛋白膠束隨著體系pH值的下降而解離，解離后酪蛋白相互聚合重新形成酸凝膠[20]。酶凝是指表面的κ-酪蛋白在蛋白酶的作用下水解釋放酪蛋白巨肽，酪蛋白膠束空間位阻減小，在鈣橋的作用下酪蛋白聚集從而形成酶凝膠[21]。在酸酶共促的凝乳過程中，酸化與凝乳酶共同作用誘導(dǎo)凝乳的形成。酸酶共促形成的凝膠中存在鈣橋，可以增強凝膠結(jié)構(gòu)的強度，酸酶共促的方法也因此有更加廣泛的應(yīng)用[22]。乳餅?zāi)榻Y(jié)構(gòu)的強弱對乳餅的理化組成影響顯著[23]。

乳餅中主要固形物是蛋白質(zhì)和脂肪，研究其含量、回收率及乳餅得率對于乳餅的工業(yè)化生產(chǎn)有重要意義[24]。3組凝乳方法制作出乳餅的理化性質(zhì)如表2所示，傳統(tǒng)酸凝組和青羊參凝乳劑組制得乳餅的含水率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)沒有顯著差異(P>0.05)，但青羊參凝乳劑組的脂肪質(zhì)量分數(shù)更高；傳統(tǒng)浸泡組的蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)和脂肪質(zhì)量分數(shù)最低但含水率最高。對于回收率而言，青羊參凝乳劑組有最高的蛋白質(zhì)回收率((83.84±2.32)%)和脂肪回收率((78.31±1.98)%)，較傳統(tǒng)浸泡組分別提高了20.26和33.04個百分點。該結(jié)果與青羊參凝乳劑組有較高的蛋白質(zhì)和脂肪質(zhì)量分數(shù)一致，且說明使用青羊參凝乳劑可以有效減少乳餅制作過程中蛋白質(zhì)和脂肪的損失；傳統(tǒng)酸凝組與傳統(tǒng)浸泡組的得率沒有顯著差異(P>0.05)，而青羊參凝乳劑組得率較其他兩組顯著提升，提高了3個百分點左右。

表2　不同凝乳方法制得乳餅的組分含量、回收率及得率Tab.2　Compositions, yield and recovery rate of milk cake made by different coagulants　%

注：不同字母表示同一行數(shù)據(jù)之間差異顯著(P<0.05)。

2.3　乳餅質(zhì)構(gòu)特性

質(zhì)構(gòu)是影響消費者購買乳餅的關(guān)鍵品質(zhì)之一。其中，硬度是奶餅質(zhì)構(gòu)特性的重要指標，乳餅屬于新鮮干酪，硬度不能過軟也不能過硬[25]。3組乳餅的硬度如表3所示：傳統(tǒng)酸凝組的硬度最高；使用蛋白酶凝乳劑制作乳餅可減小乳餅的硬度，使其質(zhì)地更加柔軟；傳統(tǒng)浸泡組的硬度最低。含水率和脂肪含量以及乳餅?zāi)榉绞接绊懭轱灲Y(jié)構(gòu)，進而影響乳餅的硬度[26]。

表3　不同凝乳方法制得乳餅的質(zhì)構(gòu)特性Tab.3　Texture properties of milk cake made by different coagulants

注：不同字母表示同一行數(shù)據(jù)之間差異顯著(P<0.05)。

傳統(tǒng)酸凝組和青羊參凝乳劑組的彈性沒有顯著差異(P>0.05)；傳統(tǒng)浸泡液組的彈性最小(0.47±0.01)，其原因是傳統(tǒng)浸泡液組的乳餅含水率很高，體系中很多蛋白質(zhì)之間的鍵可以松弛和重組，導(dǎo)致了酪蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的更快重組[27]，在下壓后酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)快速重組，回彈程度低，彈性小。

粘著度是乳餅的重要感官評價指標之一，由表3可以看出傳統(tǒng)酸凝組的粘著度最低。乳餅的粘著度受其凝膠結(jié)構(gòu)強度的影響[28]，在酸凝工藝的pH值條件下，酪蛋白膠束中以磷酸鈣形式存在的鈣離子完全釋放[27]，在酸酶共促的pH值條件下，酪蛋白膠束中還存磷酸鈣[29]，在凝膠過程中還可形成鈣橋。相較氫鍵和疏水作用力形成的凝膠結(jié)構(gòu)，擁有鈣橋的凝膠結(jié)構(gòu)擁有更高的強度，因而具有較大的粘著度[30]。傳統(tǒng)浸泡組的乳餅粘著度比青羊參凝乳劑組的小，這是因為傳統(tǒng)浸泡組乳餅中含有大量水分且乳餅的結(jié)構(gòu)不固定，擠壓時會有大量的水滲出，降低了乳餅的粘著度。

2.4　乳餅微觀結(jié)構(gòu)

利用激光共聚焦熒光顯微鏡，對用不同加工工藝制得乳餅的微觀結(jié)構(gòu)進行觀測，結(jié)果如圖1所示，其中紅色熒光表示脂肪球，綠色熒光代表蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)酸凝組制作的乳餅酪蛋白網(wǎng)絡(luò)分布不均，酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)致密，酪蛋白基質(zhì)強度較大，而脂肪形成大塊游離油脂浮于酪蛋白膠束網(wǎng)絡(luò)之外(圖1a)，從而導(dǎo)致乳餅硬度較大[31]，這也與質(zhì)構(gòu)特性的結(jié)果一致(表3)。

圖1　不同加工方法制得乳餅的微觀結(jié)構(gòu)Fig.1　Microstructures of milk cake made by different coagulants

傳統(tǒng)浸泡組制得的乳餅酪蛋白結(jié)構(gòu)松散，未形成較強的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，大量脂肪在凝乳過程中隨乳清排出，剩余的脂肪不均勻地分布在角落的酪蛋白網(wǎng)絡(luò)中(圖1b)。這種松散的凝膠結(jié)構(gòu)也導(dǎo)致了傳統(tǒng)浸泡組乳餅硬度小、彈性小等質(zhì)量缺陷。這是由于浸泡無法高效提取青羊參中的凝乳成分，且浸泡液中雜質(zhì)較多，制得的乳餅無法固定成型，酪蛋白形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散且易被破壞，不能對脂肪球起到有效的鎖定作用，脂肪多以游離脂肪的形式存在，游離在乳清通道，并在乳餅擠壓成型時隨水分流出較多，損失較大，這與傳統(tǒng)浸泡組脂肪含量低、脂肪回收率低等結(jié)果一致(表2)。

青羊參凝乳劑組的乳餅酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均一，粒徑一致的脂肪球均勻地鑲嵌在酪蛋白網(wǎng)絡(luò)中(圖1c)，這種結(jié)構(gòu)可以賦予乳餅更加柔軟的質(zhì)地和細膩的口感[25]。與傳統(tǒng)酸凝組、傳統(tǒng)浸泡組相比，添加青羊參凝乳劑可以形成孔隙更加均一的酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增強對脂肪球的鎖定效果，從而提高脂肪回收率，降低乳餅的硬度，使乳餅質(zhì)地更加柔軟。

3　結(jié)束語

從云南特色植物青羊參中提取有效凝乳成分制備新型凝乳劑，并將其應(yīng)用于云南傳統(tǒng)乳餅的制作。青羊參蛋白酶最佳提取工藝為：青羊參葉子以液料比20 mL/g浸泡在檸檬酸-磷酸緩沖液中于4℃浸提2 h。與傳統(tǒng)乳餅制作方法相比，使用青羊參凝乳劑可以顯著提高乳餅的蛋白、脂肪回收率及得率；所制得的乳餅有更均勻、細致的凝乳結(jié)構(gòu)，更適宜的硬度和較高的粘著度。研究結(jié)果為青羊參凝乳劑的應(yīng)用及云南傳統(tǒng)乳餅工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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