閆廣偉，丁燕子，邢金芳，代延朋，杜紅梅，袁恩武

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052

滋養(yǎng)細(xì)胞由妊娠初期胚胎外胚層細(xì)胞衍生而來，可分為細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞和中間型滋養(yǎng)細(xì)胞，其中細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞為滋養(yǎng)干細(xì)胞，隨著妊娠的形成分化發(fā)育成絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞兩種類型[1]。絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞可以侵入子宮螺旋動(dòng)脈和血管內(nèi)皮，子宮螺旋動(dòng)脈重鑄能夠保證足夠的胎盤灌流維持正常妊娠。妊娠早期胎盤發(fā)育處于相對低氧(2%～5%氧濃度)環(huán)境，蛻膜組織氧濃度在8%左右[2]，而此時(shí)氧濃度是影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性的關(guān)鍵因素。作為胎盤的主要成分，低氧條件下滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化、侵襲性等生理功能的變化受眾多信號通路的調(diào)節(jié)，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能障礙可導(dǎo)致子癇前期、胎兒生長受限、流產(chǎn)等疾病[3-4]。自噬是一種存在于真核細(xì)胞中依賴溶酶體途徑消化降解自身成分的過程，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)和Beclin 1是兩個(gè)重要的自噬相關(guān)分子，檢測二者的表達(dá)可以判斷細(xì)胞自噬的活性[5]。研究[6-7]表明，胎盤細(xì)胞自噬在維持正常妊娠過程起重要作用，自噬過度或自噬不足與多種妊娠期疾病有關(guān)。滋養(yǎng)細(xì)胞自噬同樣受到眾多信號通路的調(diào)節(jié)，研究[8]顯示缺氧條件下原代培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞自噬水平增強(qiáng)，然而低氧誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制尚不完全明了。本研究以絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo為研究對象，采用缺氧和自噬抑制劑3-MA處理滋養(yǎng)細(xì)胞，對HIF-1α/BNIP3信號通路的關(guān)鍵因子進(jìn)行檢測，探討低氧對滋養(yǎng)細(xì)胞自噬和侵襲性的影響及其機(jī)制，為妊娠期缺氧性相關(guān)疾病的研究提供理論依據(jù)和新的思路。

1　材料與方法

1.1主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)基購自北京索萊寶公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰蛋白酶購自美國HyClone公司，自噬抑制劑3-MA為美國Selleck公司產(chǎn)品，熒光定量試劑盒SYBI Green購自日本TOYOBO公司，Transwell小室購自Corning Costar公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司，HIF-1α、BNIP3兔抗人一抗購自美國Abcam公司，LC3、Beclin 1兔抗人一抗購自美國CST公司。滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo購自美國ATCC公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組將HTR-8/SVneo細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞以105mL-1的密度接種于6孔板，每孔2 mL，待細(xì)胞達(dá)70%融合時(shí)更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后分為3組：常氧組在正常條件下培養(yǎng)細(xì)胞，缺氧組加入終濃度為200 μmol/L 的CoCl2，3-MA+缺氧組在缺氧組基礎(chǔ)上加入終濃度為5 mmol/L 3-MA。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行1.3和1.4的檢測。

1.3Real-timePCR檢測HIF-1α、BNIP3mRNA的表達(dá)量Trizol一步法提取常氧組和缺氧組細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，置于熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s,共40個(gè)循環(huán)。PCR引物(表1)由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。采用2-ΔΔCT法計(jì)算HIF-1α、BNIP3 mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1　Real-time PCR擴(kuò)增引物序列及擴(kuò)增片段長度

F:上游引物；R:下游引物

1.4Westernblot檢測HIF-1α、BNIP3、Beclin1和LC3蛋白表達(dá)量收集常氧組和缺氧組細(xì)胞,用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，之后經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后加入按比例稀釋后HIF-1α、BNIP3一抗(按11 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，第2天取出室溫平衡后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(按110 000稀釋)，室溫避光孵育1 h，1×TBST洗膜3遍，ECL化學(xué)發(fā)光檢測，最后采用Odyssey Clx紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析目的條帶。另取3組細(xì)胞，同上測Beclin 1、LC3蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲力在Transwell小室內(nèi)加入100 μL按照18稀釋的Matrigel基質(zhì)膠，將小室放入24孔板內(nèi)置恒溫培養(yǎng)箱孵育4 h，上室加入200 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為5×105mL-1)，下室加入600 μL含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱，待細(xì)胞貼壁后，上室按照分組加入CoCl2、3-MA或不處理，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出24孔板，用棉簽輕輕擦去上室培養(yǎng)基和未穿透細(xì)胞，PBS溶液輕輕沖洗3遍后，用體積分?jǐn)?shù)4%甲醇固定30 min，在小室內(nèi)加入蘇木精染色15 min，置倒置顯微鏡(×400)下觀察，拍照并計(jì)數(shù)，每個(gè)Transwell小室計(jì)數(shù)5個(gè)視野。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較常氧組和缺氧組HIF-1α、BNIP3 mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異，采用單因素方差分析比較常氧組、缺氧組和3-MA+缺氧組Beclin 1和LC3蛋白的表達(dá)水平及侵襲細(xì)胞數(shù)的差異,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1缺氧對滋養(yǎng)細(xì)胞HIF-1α、BNIP3mRNA及蛋白表達(dá)的影響Real-time PCR結(jié)果顯示：與常氧組相比，缺氧處理24 h后滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo中HIF-1α mRNA表達(dá)水平無明顯變化，BNIP3 mRNA表達(dá)水平升高，HIF-1α、BNIP3蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，見圖1、表2。

1：常氧組；2：缺氧組圖1　缺氧后滋養(yǎng)細(xì)胞HIF-1α及BNIP3蛋白的表達(dá)

表2　缺氧條件下滋養(yǎng)細(xì)胞HIF-1α、BNIP3 mRNA和蛋白的表達(dá)

2.2缺氧和3-MA對滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin1蛋白表達(dá)的影響與常氧組相比，經(jīng)缺氧處理24 h后，滋養(yǎng)細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表達(dá)水平升高；與缺氧組相比，3-MA+缺氧組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平降低，同時(shí)Beclin 1蛋白表達(dá)水平下降(圖2、表3)。

1：常氧組；2：缺氧組；3：3-MA+缺氧組圖2　3組滋養(yǎng)細(xì)胞Beclin 1、LC3蛋白的表達(dá)

2.3缺氧和3-MA對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的影響缺氧組侵襲細(xì)胞數(shù)高于常氧組，但在缺氧條件下使用自噬抑制劑3-MA后侵襲細(xì)胞數(shù)減少(圖3、表3)。

A：常氧組；B：缺氧組；C：3-MA+缺氧組圖3　3組滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)比較(×400)

表3　3組滋養(yǎng)細(xì)胞Beclin 1、LC3蛋白的表達(dá)水平及侵襲細(xì)胞數(shù)的比較

*:與常氧組相比，P<0.05；#:與缺氧組相比，P<0.05

3　討論

妊娠期胎盤是維持胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育的重要器官，胎盤是母體與胎兒進(jìn)行氧交換和二氧化碳交換的主要場所。本課題組前期研究[9]顯示稽留流產(chǎn)胎盤絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比值下降，同時(shí)HIF-1α/BNIP3信號通路在這個(gè)過程中起重要作用 。Wu等[4]的研究表明滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的改變可能是流產(chǎn)發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。正常妊娠12周后，絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞可侵入子宮螺旋動(dòng)脈取代其血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與平滑肌細(xì)胞的降解[10]，在胚胎植入、胎兒發(fā)育、建立有效的母胎循環(huán)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

HIF-1α是細(xì)胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，與HIF-1β構(gòu)成異二聚體，可調(diào)控100多種靶基因的表達(dá)，在調(diào)節(jié)血管形成、胎盤和胚胎發(fā)育、糖代謝及細(xì)胞凋亡和自噬過程中扮演重要角色。Dubinsky等[11]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)，參與控制了滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入和遷移。研究[12]已證實(shí)BNIP3參與細(xì)胞凋亡、自噬和細(xì)胞壞死等過程；BNIP3在機(jī)體缺氧條件下會(huì)急劇升高，其表達(dá)受HIF-1α的調(diào)控。本研究以絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo為研究對象，采用CoCl2處理模擬細(xì)胞缺氧模型[13]，結(jié)果顯示缺氧處理24 h后HIF-1α、BNIP3蛋白及BNIP3 mRNA的表達(dá)水平均升高，但HIF-1α mRNA的表達(dá)水平無明顯改變。

LC3是自噬體膜上重要的標(biāo)記蛋白，它在細(xì)胞內(nèi)以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種形式存在。在自噬發(fā)生過程中， LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ并定位于自噬體膜，因此LC3Ⅱ/Ⅰ可以反映自噬水平的高低[14]。Beclin 1是酵母ATG6/Vps30基因在哺乳動(dòng)物中的同源物，位于人類染色體17q21，主要通過與ClassⅢ PI3K和Atg14L結(jié)合形成復(fù)合體調(diào)控自噬體的形成[15]。低氧條件下，活化的HIF-1α通過上調(diào)BNIP3將Beclin 1從Beclin 1/Bcl-2復(fù)合體解離釋放，激活自噬[16]。本研究結(jié)果顯示滋養(yǎng)細(xì)胞缺氧后，自噬標(biāo)志蛋白Beclin 1及 LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)均升高，而加用自噬抑制劑3-MA后滋養(yǎng)細(xì)胞Beclin 1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平降低。這一發(fā)現(xiàn)表明缺氧可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的發(fā)生，HIF-1α/BNIP3途徑可能在此過程中起重要作用。

滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、浸潤是一個(gè)多因素參與調(diào)節(jié)、多步驟的復(fù)雜過程。有研究[17]顯示缺氧條件下人絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-2表達(dá)升高并使細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)，同時(shí)MMP-9和TIMP-1表達(dá)升高；缺氧可通過MMP-9/TIMP-1來調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲性。Maltepe等[18]研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)細(xì)胞在低氧條件下可以通過激活HIF-1α影響其侵襲能力。研究[19-20]顯示，腫瘤細(xì)胞自噬與其侵襲性存在復(fù)雜關(guān)系，然而自噬與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性的相關(guān)研究國內(nèi)外較少。本研究結(jié)果顯示，HTR-8/SVneo細(xì)胞缺氧24 h后侵襲細(xì)胞數(shù)量比常氧組增多，此外，自噬抑制劑3-MA對缺氧后滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力有抑制作用，這表明自噬抑制劑可能通過抑制缺氧誘導(dǎo)的自噬從而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)合前期研究，我們推測在低氧環(huán)境中，稽留流產(chǎn)患者絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬減弱，滋養(yǎng)細(xì)胞處于低浸潤能力狀態(tài),不足以應(yīng)對缺氧環(huán)境帶來的壓力，無法正常促進(jìn)胚泡植入和胎盤形成，從而導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育，發(fā)生稽留流產(chǎn)[9]。

綜上所述，低氧可能通過HIF-1α/BNIP3途徑誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞自噬并影響其侵襲能力，自噬抑制劑3-MA通過抑制低氧條件下滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的發(fā)生從而降低其侵襲性。缺氧環(huán)境中滋養(yǎng)細(xì)胞自噬、侵襲性和妊娠期相關(guān)疾病之間存在錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，仍需進(jìn)一步深入研究。

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