陳 祺(綜述) 魏魁杰(審校)

(復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院口腔科 上海 201700)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一。其發(fā)生發(fā)展過程是一系列遺傳因素、內(nèi)部穩(wěn)態(tài)和外部環(huán)境綜合作用的結(jié)果,表現(xiàn)為癌基因激活或抑癌基因失活兩方面,從而誘發(fā)腫瘤形成。同時,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,細胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成等一系列生物學行為均會發(fā)生改變。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的小分子RNA,與靶mRNA分子結(jié)合后可以使mRNA降解并抑制蛋白質(zhì)翻譯,進而調(diào)控靶基因的表達,在細胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學行為中起重要作用。前期研究證實miRNA對多種腫瘤的生物學行為發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在OSCC中,miRNA的異常表達同樣可影響腫瘤細胞多種生物學功能。miRNA種類繁多,對OSCC的發(fā)生發(fā)展參與過程主要可以概括為以下3點:調(diào)控癌基因的表達,細胞周期、增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移,血管增生和細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。

調(diào)控OSCC基因的表達miRNA是一類長度為18～24個核糖核苷酸的小分子RNA,其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為pri-miRNA,在細胞質(zhì)加工后成為短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA,shRNA),再通過核酸酶的剪切修飾成為成熟的miRNA。前期研究顯示:在人類腫瘤中大約有50%的miRNA基因定位于相關腫瘤的基因位點上,表明與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展關聯(lián),而其異常轉(zhuǎn)錄和表達同樣在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。miRNA調(diào)控癌基因作用包括兩方面:當激活癌基因時,可引起癌基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物的過量表達,促進癌變過程。當抑制癌基因時,可促進腫瘤細胞的凋亡,從而達到抑制腫瘤的目的。同樣,當miRNA靶分子是某些腫瘤抑制性基因或控制細胞分化、凋亡的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物時,miRNA表達增加會抑制靶基因功能,引發(fā)癌變。不同類型miRNA通過其不同的途徑調(diào)控OSCC基因的表達來發(fā)揮重要功能。

早期研究證明:miR-125b作為膠質(zhì)母細胞瘤細胞的致癌基因,通過p53和p38MAPK非依賴性途徑抑制細胞凋亡,而在OSCC中miR-125b具有特異性表達,Yan等[1]實驗顯示:hsa-miR-125b在OSCC樣品中表達下調(diào),誘導各種過程和途徑的變化,并且提供進一步誘導OSCC的機制水平,通過發(fā)揮對p35基因表達的負調(diào)控和其下游大分子生物過程(長期增強和黏附連接途徑)來實現(xiàn)?？偠灾?miR-125b在OSCC的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用,是對其癌基因的調(diào)控而發(fā)揮作用。

miR-26是一種對腫瘤具有抑制性作用的miRNA,發(fā)揮抑癌基因作用,其表達降低可促進腫瘤發(fā)生。相關免疫學檢測證實Wnt5a mRNA是miR-26a的直接靶分子,miR-26a可以作用于 Wnt5a mRNA而抑制OSCC。研究還表明:miR-26a的下游靶分子還包括EZH2、PTEN、MCL-1和 MTDH的mRNA等,均可能在OSCC中作為抑癌基因來抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

miR-211是腫瘤中最常見的miRNA之一,在OSCC形成過程中同樣發(fā)揮癌基因作用,可以作用于多個參與腫瘤血管形成、癌細胞凋亡的基因。Chen等[2]實驗發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠中使用4-硝基喹啉1-氧化物(4NQO)可誘導口腔致癌作用,在OSCC細胞中,4NQO和arecoline可誘導miR-211表達上調(diào),miR-211作為癌基因通過抑制TCF12和增加抗氧化活性來增強致癌性,從而誘導OSCC的發(fā)生。

Christopher等[3]在miRNA-mRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡中分析了炎癥細胞和其調(diào)節(jié)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,參與信號通路的相互作用基因,發(fā)現(xiàn)miR-19a/b在OSCC中的控制炎癥反應中顯示出重要的的影響。同時,微管蛋白作為miR-19a/b的靶分子和失調(diào)的基因在炎癥中可識別miRNA-mRNA,對于OSCC的診治可能具有重要應用。

miR-494-3p在OSCC中的重要作用已被證實。Weng等[4]研究發(fā)現(xiàn)miR-494-3p在OSCC中起抑制靶基因轉(zhuǎn)錄表達作用。Bmi1 mRNA作為miR-494-3p的靶分子,在SAS細胞中低表達,從而抑制p16INK4a和視網(wǎng)膜母細胞瘤1(RB1)的表達。在OSCC組織中觀察到Bmi1和miR-494-3p表達之間的逆相關性,miR-494-3p可以通過誘導由Bmi1基因表達下調(diào)引起OSCC細胞衰老和增加其放射敏感性。

Cheng等[5]調(diào)查了40對OSCC標本和匹配的非腫瘤上皮組織中miRNA的表達譜,數(shù)據(jù)顯示腫瘤組織中的miR-455-5p表達高于正常組織。此外,通過免疫分析發(fā)現(xiàn)泛素綴合酶E2B(UBE2B)的mRNA作為miR-455-5p的靶分子,其mRNA水平可促進OSCC的發(fā)生,而這一表達受TGF-β依賴性途徑的調(diào)節(jié),其隨后導致UBE2B基因表達下調(diào)并促進OSCC發(fā)生。

調(diào)控OSCC細胞周期、增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管增生miRNA在OSCC中除了通過調(diào)控腫瘤相關基因,發(fā)揮促癌基因和抑癌基因作用,還可以通過直接調(diào)節(jié)細胞周期、增殖、凋亡、腫瘤血管增生、侵襲和轉(zhuǎn)移等發(fā)揮相應功能。

調(diào)控OSCC細胞周期 正常細胞周期的穩(wěn)定性由細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶 (cyclin dependent kinase,CDK)的共同作用產(chǎn)生。主要包括4個時期:G1/S 轉(zhuǎn)換期、G1 期、S 期、G2/M 轉(zhuǎn)換期,在每個期都會有對應miRNA調(diào)控蛋白發(fā)揮作用,特別是在G1/S 期,起主要作用的蛋白主要包括BCL6、細胞周期蛋白D2、CyclinD1和Bcl-2、CDK6等。眾多miRNA在調(diào)控腫瘤細胞周期中具有重要作用,而在OSCC中,主要包括以下類型miRNA。

miR-34具有多種家族成員,其中miR-34a和miR-34b/c最為重要,前期研究證實:在OSCC中,作為P53的靶基因,miR-34a和miR-34b/c可以抑制 MET、CDK4、CCNE2和MYC等細胞周期相關基因表達,從而抑制細胞周期,發(fā)揮抑制腫瘤作用。

Zeng等[6]在研究中分析了miR-155對其靶基因B細胞CLL /淋巴瘤6(BCL6)和下游基因細胞周期蛋白D2(CCND2)的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-155在OSCC細胞和腫瘤組織中的表達明顯高于對照組,miR-155模擬物可以下調(diào)BCL6水平和增加細胞周期蛋白D2表達。而且,用miR-155引物可以上調(diào)BCL6和減少細胞周期蛋白D2表達。這些結(jié)果表明miR-155通過調(diào)節(jié)BCL6 /細胞周期蛋白D2軸在OSCC中起腫瘤促進作用。

Wang等[7]研究顯示miR-182在OSCC組織表達明顯增高,相關免疫學實驗表明其與RASA1和SPRED1的蛋白質(zhì)表達負相關,miR-182的過表達維持了Ras-MEK-ERK信號通路活化,促進了細胞周期的進展,表明miR-182通過直接靶向和抑制RASA1和SPRED1發(fā)揮其致癌作用。

miR-143作為腫瘤抑制劑為人所知。Sun等[8]最新研究發(fā)現(xiàn)定己糖激酶2(HK2)是OSCC細胞中miR-143的直接靶分子,其3′非翻譯區(qū)(UTR)可與miR-143互相配對,誘發(fā)體內(nèi)外糖酵解的抑制,其中很重要的效應便是顯著引起G1期的細胞周期停滯,從而達到抑制OSCC的作用。

調(diào)控OSCC細胞增殖、凋亡 腫瘤細胞增殖過程由促進細胞分裂增殖的信號分子和抑制細胞分裂增殖的信號分子共同調(diào)節(jié)來達到平衡狀態(tài)。有很多miRNA可直接調(diào)控細胞增殖相關的調(diào)節(jié)蛋白,這些調(diào)節(jié)蛋白如K-ras、MTSS1、PTGS2、LAMC1、HDAC7、PAX6、PRKC、CDC73、CD71,TfR-1等。正常細胞中細胞的增殖和凋亡通常處于相對平衡狀態(tài),如果這種狀態(tài)被打破,則可發(fā)生細胞凋亡。miRNA可以通過直接靶向調(diào)節(jié)細胞凋亡調(diào)控相關基因的轉(zhuǎn)錄,參與到腫瘤細胞凋亡的調(diào)節(jié)過程中。不同類型的miRNA在OSCC中通過上述原理發(fā)揮調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡的作用。典型的miRNA包括以下幾種:

在許多類型腫瘤中miR-218通常呈低表達狀態(tài),可以抑制癌細胞的增殖,促進細胞凋亡。而在OSCC中,miR-218主要通過降低雷帕霉素不敏感復合體 Rictor的表達水平,抑制Akt S473的磷酸化促進OSCC的發(fā)生。

多種miRNA在舌鱗狀細胞癌中發(fā)揮重要作用。Jia等[9]研究表明通過miR-29b/Sp1/PTEN/AKT 這一信號軸來調(diào)控舌鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展。Guo等[10]證實miR-96通過靶基因轉(zhuǎn)移抑制基因1( metastasis suppressor-1,MTSS1)發(fā)揮對MTSS1的表達的調(diào)節(jié),從而促進癌細胞的增殖和凋亡。Cao等[11]發(fā)現(xiàn)在舌鱗狀細胞癌中miR-26b的靶分子是前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶-2 ( prostaglandin-endoperoxide synthase-2,PTGS2) 的mRNA,表達生成COX-2,并通過此調(diào)控機制抑制了舌鱗狀細胞癌細胞的增殖和凋亡能力。

Du等[12]研究顯示miR-98在OSCC組織和細胞系中下調(diào)。miR-98的過表達抑制OSCC細胞的增殖,集落形成。免疫學實驗表明IGF1R為miR-98的潛在靶標,IGF1R的恢復顯著促進miR-98對OSCC細胞的腫瘤抑制作用。 此外,miR-98表達與OSCC病例中的IGF1R表達呈負相關。這些結(jié)果表明miR-98通過直接靶向IGF1R抑制癌細胞增殖和生長。

Jin等[13]研究表明:在OSCC細胞中,淫羊藿素(icaritin)誘發(fā)線粒體凋亡途徑包括對線粒體膜電位的丟失影響和促進細胞色素C的釋放,而miR-124的上調(diào)表達可以促進icaritin以劑量和時間依賴的方式抑制腫瘤細胞活力,從而通過內(nèi)源性線粒體途徑誘導細胞凋亡,而icaritin對miR-124發(fā)揮調(diào)節(jié)作用主要通過抑制Sp1 / DNMT1信號轉(zhuǎn)導通路產(chǎn)生的。

調(diào)控口腔鱗狀癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移 前期研究表明,miRNA可介導多種腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的過程。而在OSCC中,很多miRNA發(fā)揮這種功能。

miR-204-5通常被認為是腫瘤抑制劑之一,Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn),在OSCC中miR-204-5p是CXCR4的調(diào)節(jié)性miRNA,其表達在癌組織或細胞中較低,可以增強OSCC細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。并且數(shù)據(jù)分析表明,在OSCC組織中miR-204-5p和CXCR4表達之間存在負相關。提示我們:miR-204-5p可能通過抑制OSCC中的CXCR4表達來調(diào)節(jié)癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

Liu等[15]研究顯示:miR-338在OSCC組織和細胞系中顯著下調(diào)。miR-338的過表達顯著抑制OSCC細胞的增殖、遷移和侵襲。 此外,神經(jīng)黏蛋白1(NRP1)被確定為miR-338在OSCC細胞中的靶標,并與miR-338在OSCC組織中逆相關。 此外,NRP1的恢復削弱了miR-338的腫瘤抑制作用?？傊?miR-338可能通過靶向NRP1抑制OSCC細胞的生長和轉(zhuǎn)移。

miR-101在OSCC中顯著下調(diào)。Hui等[16]實驗表明miR-101在OSCC組織和細胞系中呈低表達。作為腫瘤發(fā)生發(fā)展的啟動子,miR-101可能潛在靶向作用CX趨化因子受體7(CXCR7),減弱OSCC進展。過度表達miR-101的OSCC細胞中可出現(xiàn)CXCR7的異位表達,從而消除miR-101的增殖和運動能力。而CXCR7表達在OSCC組織中上調(diào)?？傊?miR-101通過靶向CXCR7發(fā)揮腫瘤抑制功能,可抑制OSCC細胞生長,侵襲和遷移。

前期研究指出,miR-21在OSCC發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用,通過調(diào)控 Bcl-2、 PTEN、TPM1 等分子參與腫瘤形成、浸潤與轉(zhuǎn)移。Li等[17]實驗發(fā)現(xiàn)缺氧是實體瘤的常見特征,且與侵襲性相關,miR-21是在缺氧條件下最顯著上調(diào)的miRNA之一。缺氧OSCC細胞中miR-21耗盡導致外來體中miR-21水平降低,并顯著降低細胞遷移和侵襲。相反,HIF-1α和HIF-2α耗盡了外來體中miR-21,從而使其表達恢復,促進了OSCC細胞遷移和侵襲。此外,外來體miR-21顯著增強蝸牛和波形蛋白的表達,同時在體外和體內(nèi)顯著降低OSCC細胞中的E-鈣粘蛋白水平,miR-21水平與HIF-1α/HIF-2α表達密切相關?？傊?缺氧微環(huán)境可能刺激腫瘤細胞生成包含miR-21的豐富外來體,并被送到正常細胞,促進侵襲行為。

相關研究表明,miR-196b在許多類型的癌癥中具有致癌或腫瘤抑制功能,在OSCC中的生物學作用也具有重要參考意義。Hou等[18]在OSCC患者的癌組織和相鄰正常組織中使用免疫學檢查miR-196b的表達水平得出:與相鄰正常組織樣本相比,miR-196b在癌組織中顯著過表達,而且癌組織中位于miR-196b基因上游的CpG島比鄰近正常組織中更多的低甲基化,和甲基化狀態(tài)的miR-196b與其表達水平成反比,功能分析顯示異位miR-196b表達促進口腔癌細胞遷移和侵襲能力,并且沉默miR-196b可以消除OSCC細胞的體外遷移和侵襲。

Lin等[19]研究顯示miR-187可增加OSCC細胞的致癌性,特別是遷移功能。此外發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性人類OSCC具有比非轉(zhuǎn)移性腫瘤更高的miR-187表達。篩選檢測證實BarHomeobox2(BARX2)基因作為miR-187靶目標。BARX2表達在大多數(shù)OSCC下調(diào),而且可以抑制OSCC細胞遷移、入侵?？傊?相關實驗結(jié)果表明miR-187對OSCC細胞的遷移功能發(fā)揮重要作用。

miR-1254是最新腫瘤機制研究的眾多成果之一,其中Lu等[20]實驗證實了miR-1254在OSCC中的重要影響,即減弱OSCC轉(zhuǎn)移侵襲,其基本機理是:miR-1254可以顯著下調(diào)MAP3K3,伴隨著MAPK信號通路的失活和抑制上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。在OSCC細胞中,miR-1254被c-Myc轉(zhuǎn)錄抑制,通過MAPK信號轉(zhuǎn)導形成正反饋環(huán),減弱OSCC的轉(zhuǎn)移侵襲功能。

Peng等[21]研究表明miR-1在OSCC細胞中明顯下調(diào)表達,其過度表達可以降低OSCC細胞的侵襲和遷移能力,同時,也降低了癌癥干細胞特性,而其基本原理是miR-1能夠靶向Slug,抑制OSCC細胞的表達,從而發(fā)揮對OSCC的抑制功能。

調(diào)控口腔鱗狀細胞癌血管增生 前期研究結(jié)果顯示:miRNA可通過調(diào)控VEGF-A、Drosha、HIF等相關蛋白的表達來參與調(diào)節(jié)血管增生過程。其中一部分miRNA被發(fā)現(xiàn)能促進腫瘤內(nèi)的血管增生,另外一部分miRNA 能夠抑制腫瘤內(nèi)的血管增生,而在OSCC中,部分miRNA發(fā)揮上述作用。

Sasahira等[22]研究發(fā)現(xiàn)miR-126在OSCC中的表達下調(diào),對微血管生成因子(VEGF)-A 的表達具有抑制作用,促進腫瘤血管及淋巴管形成,從而導致OSCC的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等過程。具有相似作用的還有miR-31,在OSCC細胞中的作用主要體現(xiàn)在促進缺氧誘導因子HIF的表達,激活 HIF信號通路,促進腫瘤血管生成。

口腔鱗癌中miRNA的EMTEMT在腫瘤細胞生物學行為中發(fā)揮重要作用,其基本原理是:腫瘤上皮細胞失去細胞間的黏附和接觸,細胞中上皮細胞鈣黏蛋白表達下降并獲得間質(zhì)細胞特征,波形蛋白表達增加,細胞凋亡受到抑制,從而導致細胞的運動和侵襲能力增強。前期研究證據(jù)表明EMT對多種腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲起到重要作用。在腫瘤微環(huán)境中炎癥因子能促發(fā)并激活轉(zhuǎn)錄因子的表達,包括 SDF1、Snail、Slug、YAP1、Twist、ZEB1 和 ZEB2等相關因子和蛋白,這些因子均能誘發(fā)EMT的發(fā)生。在OSCC中miRNA主要通過兩種方式發(fā)揮作用:直接參與EMT的基因調(diào)節(jié)EMT過程,也可以調(diào)節(jié)能夠促進或抑制EMT的蛋白含量,間接參與調(diào)節(jié)EMT過程。

相關研究顯示miR-320在OSCC中作用機制主要為:Rac1作為miR-320的靶分子,具有調(diào)節(jié)細胞骨架結(jié)構(gòu)、細胞間黏附及細胞基質(zhì)降解等功能。而miR-320直接靶向Rac1可抑制腫瘤細胞EMT等過程。

Zeng等[23]通過相關實驗發(fā)現(xiàn)YAP1(YES相關蛋白-1)是miR-27a-3p的靶基因。增加miR-27a-3p的表達可以顯著降低YAP1以及OSCC細胞系(包括Twist和Snail)中的幾種EMT相關分子的表達水平。隨后研究表明,miR-27a-3p表達能夠有效下調(diào)EMT相關分子,這可能通過YAP1-OCT4-Sox2信號軸參與Sox2的調(diào)節(jié)。同時,miR-27a-3p可通過轉(zhuǎn)錄后沉默直接抑制YAP1,并可能抑制EMT過程,表明miR-27a-3p可能通過EMT抑制在OSCC細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。

Ghosh等[24]研究顯示:miRNA在順鉑耐藥的發(fā)展中起重要作用,主要是通過調(diào)節(jié)EMT型特性。相關蛋白包括P-糖蛋白(ABCB1)、c-Myc、存活素和β-聯(lián)蛋白,這些蛋白在順鉑抗性OSCC細胞系中顯著上調(diào),同時CD44表達增加,而損失的E-鈣黏蛋白信號同樣可以誘導EMT表型。總之,miRNA可以通過調(diào)節(jié)OSCC中EMT轉(zhuǎn)換型性質(zhì),在順鉑抗性口腔鱗狀細胞癌細胞系中起重要作用。

Yu等[25]相關實驗發(fā)現(xiàn):miRNA是癌癥相關標志的關鍵參與者,特別是在EMT過程中。本實驗中顯示miR-204過度表達可以抑制癌癥干細胞和OSCC-CSCs。miR-204是通過結(jié)合其Slug和Sox4的3’-UTR區(qū)并抑制其在OSCC-CSCs中的表達。此外,sh-Slug和sh-Sox4的共同敲低可以促進miR-204 EMT性質(zhì)的能力。結(jié)合相關臨床結(jié)果可證實:miR-204介導的EMT特性可以抑制OSCC細胞的生物學行為。

Hu等[26]研究顯示:在OSCC中,對比相鄰非腫瘤組織miR-497的水平顯著提高。SMAD7是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)受體信號轉(zhuǎn)導的關鍵抑制劑,其通過EMT細胞轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)癌細胞侵襲的改變。此外,miR-497和SMAD7在OSCC標本中呈負相關。生物信息學分析表明,miR-497靶向SMAD7 mRNA的3’-UTR以抑制其翻譯。此外,miR-497表達增加可以抑制SMAD7的表達。總之,數(shù)據(jù)表明miR-497在OSCC細胞可以通過EMT調(diào)節(jié)SMAD7低表達從而促進癌細胞轉(zhuǎn)移。

結(jié)語綜上所述,miRNA在OSCC中具有重要作用,參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程,不同種類的miRNA通過不同調(diào)控機制來發(fā)揮功能,在口腔癌的進展過程中miRNA的表達水平隨之變化。最新研究發(fā)現(xiàn),不同種類的miRNA在OSCC具有不同的潛信號轉(zhuǎn)導通路,通路之間的差異,也給未來miRNA的研究思路提供了參考價值,對這些通路的阻斷可以提示miRNA的內(nèi)在調(diào)控機制。隨著對miRNA調(diào)控機制不斷深入的研究,將會有更多miRNA的功能得以發(fā)現(xiàn)和應用,在OSCC中,或者其他腫瘤中,都會有很好的參考價值和應用。