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(1.貴州大學農(nóng)學院，　貴陽 550025；　2.國家小麥改良中心貴州分中心，　貴州 貴陽 550025)

硬粒小麥(TriticumDurum，AABB，2 n=28)是世界重要的糧食作物之一,最早在美國和意大利種植較多，后來傳播到北非、中東、歐洲等地并逐步擴散到世界各地。如今硬粒小麥播種面積約占世界小麥總面積的十分之一，僅次于普通小麥,居栽培小麥的第二位。硬粒小麥是一種四倍體栽培小麥[1]，其籽粒蛋白質及面筋含量都較普通小麥高，面筋較普通小麥硬，不能拉長，適合生產(chǎn)琥珀色、耐煮、光滑可口的通心粉，用硬粒小麥做的面條耐煮且有韌勁，因此又叫通心粉小麥。硬粒小麥還可以與普通小麥搭配磨粉來生產(chǎn)優(yōu)質面包和其它面食品。硬粒小麥是六倍體普通小麥的初級基因庫，含有豐富的抗性基因，對條銹、葉銹、散黑穗病和腥黑穗病等病具有較好的抗性，具有較高的育種價值[2-3]。

圖2　硬粒小麥(Sauwne 20) 的A和B基因組的FISH核型

DNA重復序列可以用于染色體辨別、基因組組成及進化分析，外源遺傳物質檢測等多項研究。Mukai等[4]以高度重復序列pSc 119.2和pAs 1為探針識別了B組和D組所有染色體以及小麥的1 A、4 A和5 A 染色體，并創(chuàng)立了中國春小麥的B基因組和D基因組染色體核型模式圖。Pedersen等[5]成功地使用pAsI和pHvG 38兩個重復序列探針識別了小麥所有的21對染色體。 Cuadrado和Jouve[6]在黑麥染色體制片上用pTa 71、pTa 794、pSc 34、pSc 74和pSc 119.2重復序列探針進行了3次熒光原位雜交，從而識別了黑麥的全部染色體。目前，對硬粒小麥的FISH核型方面的研究鮮見報道。本研究擬對硬粒小麥染色體進行雙色FISH分析，以期了解硬粒小麥染色體的FISH特點，建立其FISH核型，為硬粒小麥在小麥遺傳育種上的利用和深入研究提供參考。

1　材料與方法

1.1　材　料

試驗材料為從意大利引入的硬粒小麥品種Sauwne 20，該品種具有矮桿、千粒重大、白粒、全玻璃質等特點，并且對條、葉、稈銹病和白粉病等病表現(xiàn)高抗至免疫[7]，是小麥白粉病抗性的鑒別寄主。

1.2　染色體制片

將種子置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中于常溫下發(fā)芽，待根長至2 cm左右時，剪取根尖用N2O處理2 h，在90%冰醋酸中固定10 min,用蒸餾水沖洗3遍后切取根尖分生區(qū)，酶解滴片，在OLMPUS BX 60顯微鏡下鏡檢，選取分裂相好的片子保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3　熒光原位雜交分析

FISH技術參見Han等[8]方法。選擇FISH效果好的細胞用Cellsens Standard攝像系統(tǒng)照相。選取5個分裂相好且染色清晰的細胞用于FISH核型分析，以得到準確可靠的數(shù)據(jù)。

2　結果與分析

以Oligo-pTa 535-2(紅色)和Oligo-pSc 119.2-1(綠色)重復序列為探針對硬粒小麥Sauwne 20根尖細胞染色體進行雙色FISH分析(圖1)，結果發(fā)現(xiàn)，Sauwne 20包括14對染色體，其染色體上的Oligo-pTa 535-2紅色信號相對較弱且少，而Oligo-pSc 119.2-1綠色信號較強且豐富。

Sauwne 20的1 A染色體短臂端部和長臂中間分別具有Oligo-pTa 535-2信號(圖2)。2 A染色體短臂端部及近著絲點處分別有明亮的Oligo-pTa 535-2信號。3 A染色體著絲點處有明亮的Oligo-pTa 535-2信號。4 A染色體長臂近端部有Oligo-pTa 535-2信號, 長臂端部有Oligo-pSc 119.2-1綠色信號。5 A染色體長臂中間存在2對弱的Oligo-pTa 535-2信號。6 A染色體短臂端部和近著絲點處分別有Oligo-pTa 535-2信號。7 A染色體長臂近端部和近著絲點處分別有微弱的Oligo-pTa 535-2信號。

注：Oligo-pTa 535-2探針為紅色，Oligo-pSc 119.2-1探針為綠色，背景染色體由DAPI復染為藍色；比例尺為10 μm。下同。圖1　硬粒小麥(Sauwne 20)根尖細胞染色體的FISH核型

Sauwne 20在1 B染色體長臂端部和中間分別有Oligo-pSc 119.2-1信號。2 B染色體長臂、短臂端部及長臂中間分別有Oligo-pSc 119.2-1信號。3 B染色體短臂端部有Oligo-pSc 119.2-1和Oligo-pTa 535-2兩種信號，長臂端部有Oligo-pTa 535-2信號。4 B染色體上具有較豐富的Oligo-pSc 119.2-1信號，在短臂端部、長臂中間與端部分別具有較強的Oligo-pSc 119.2-1信號。5 B染色體短臂端部和近端部有較強的Oligo-pSc 119.2-1信號。6 B染色體長臂和短臂端部及長臂中間分別具有Oligo-pSc 119.2-1信號；短臂端部及中間分別有Oligo-pTa 535-2信號。7 B染色體在短臂近端處和長臂端部、中間分別有明顯的Oligo-pSc 119.2-1信號；長、短臂近端處分別有Oligo-pTa 535-2信號。

硬粒小麥Sauwne 20與Tang等[9]報道的中國春普通小麥的A組和B組染色體的FISH核型基本相似，但又有一定的差別。Sauwne 20的1 B和4 B染色體長臂近端處比中國春小麥多1對Oligo-pTa 535-2信號。Sauwne 20的3 B染色體短臂近端處比中國春小麥多1對Oligo-pTa 535-2信號。Sauwne 20的6 B染色體短臂近端處比中國春小麥多1對Oligo-pSc 119.2-1信號信號。Sauwne 20的7 B染色體長臂端部和近端處分別比中國春小麥多1對Oligo-pSc 119.2-1和Oligo-pTa 535-2信號。

3　討　論

建立植物的FISH核型對研究植物分類和進化具有重要的意義[10-11]。董磊等[12]對擬斯卑爾脫山羊草材料進行了FISH分析，發(fā)現(xiàn)Oligo-pTa 535信號主要分布在小麥的A組和D組染色體上，Oligo-pSc 119.2信號主要分布在小麥的B組染色體上，不同來源的擬斯卑爾脫山羊草與小麥B染色體組的FISH核型存在明顯差異；認為擬斯卑爾脫山羊草染色體上含有豐富的與pSc 119.2高度同源的重復序列，分布上具有遺傳多樣性。葛群等[13]利用普通小麥品種綿陽11作母本,抗病的威寧黑麥(ScealecerealeL.)作父本,在其雜交和回交后代中分別鑒定出一個1 R和5 R單體附加系；研究發(fā)現(xiàn)黑麥染色體1 R和5 R單體附加系可以誘導小麥染色體變異。羅巧玲等[14]分析了390份小麥-黑麥種質材料，指出3份六倍體小黑麥與2份八倍體小黑麥所含的黑麥染色體不完全相同；八倍體小黑麥中有1對來源于黑麥的小染色體,而六倍體小黑麥中沒有類似小染色體。Tang等[15]以Oligo-pTa 535-1和Oligo-pSc 119.2-1為探針進行FISH分析，并結合GISH技術對小黑麥衍生種的染色體結構變異進行了分析。劉成等[16]利用Oligo-pTa 535-1、Oligo-pSc 119.2-1和(GAA)8探針對智利大麥進行FISH分析，有效辨別了智利大麥的每一條染色體。Linc等[17]則以重復序列pSc 119.2和Afa family為探針將二倍體長穗偃麥草的7對染色體全部區(qū)分，建立了二倍體長穗偃麥草的FISH核型，并對其附加系進行了鑒定。

本研究利用雙色FISH技術可在染色體水平上準確辨別硬粒小麥Sauwne 20的每一染色體，并建立Sauwne 20的FISH核型。Sauwne 20染色體上的Oligo-pTa 535-2紅色信號相對較弱且少，而Oligo-pSc 119.2-1綠色信號較強且豐富。Sauwne 20的FISH核型與Tang等[9]報道的中國春小麥A和B組染色體的FISH核型相似，但又有一定的差別；其差異可能是由于試驗材料不同，不同小麥材料間DNA重復序列具有遺傳多樣性。Sauwne 20染色體結構變異可能是該材料形成過程中，染色體發(fā)生重復、倒位、易位、缺失等現(xiàn)象而導致染色體重復序列的變化，從而形成FISH信號的多樣性[18]。

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3　討　論

本研究以三白草作為材料分離AP1基因，通過RACE方法快速克隆出全長cDNA，獲得全長cDNA，通過測序分析，確定該基因為1 076 bp的全長cDNA序列，共編碼245個氨基酸。AP1基因既屬于花分生組織特征基因，又是花器官形態(tài)特征基因，AP1基因具有促進植物開花的作用[6]。

AP1基因在花器官發(fā)育中起關鍵作用。在花發(fā)育的ABCDE模型中，AP1基因既屬于A類基因，是萼片和花瓣正常發(fā)育所必需的，同時又能激活B類基因。AP1基因突變使一些花變成花序，導致萼片和花瓣發(fā)育異常。被子植物中有關花發(fā)育方面的研究主要集中在擬南芥、金魚草和矮牽牛等模式植物中，AP1基因在這些高等真雙子葉植物中的功能、表達以及氨基酸序列具有相似性。而在被子植物基部類群的三白草，其花序沒有花萼和花瓣，但開花時頂端3片苞葉變白，通過RT-PCR基因表達分析，發(fā)現(xiàn)在白色花瓣狀苞葉中AP1基因有表達。AP1在三白草植株開花時頂端苞片變白過程中有明顯上調，而幼葉中幾乎沒有表達，這也許與A-class基因的異位表達有關系，所以在無被花的三白草中有可能出現(xiàn)花瓣異位表達的現(xiàn)象。

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