，　

(1.貴州大學綠色農藥與農業(yè)生物工程國家重點實驗室培育基地，山地植物資源保護與種質創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，　貴陽 550025；2.貴州省農業(yè)科學院，　貴陽 550006；　3.貴州農業(yè)職業(yè)學院，　貴州 清鎮(zhèn) 550014)

草甘膦是一種高效、廣譜、低毒、低殘留、內吸傳導的滅殺性除草劑[10,13]。草甘膦作為植物體內莽草酸生物合成途徑中的競爭性抑制物，可優(yōu)先與磷酸稀醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvic acid，PEP)和莽草酸-3-磷酸(Shikimic acid-3-phosphoric acid，S 3 P)結合，阻斷芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)的合成。此過程中的關鍵酶5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)活性受抑，蛋白質合成就會受到干擾，阻止次生產物形成，最終引起植株失綠而死亡[1,11,15,18,23]。研究發(fā)現，自然界生物中存在對除草劑草甘膦產生抗性的多種基因，主要有aroA基因、cp4-EPSPS、G6等，其中cp4-EPSPS基因已廣泛應用[22]。研究發(fā)現，EPSPS基因對草甘膦產生抗性主要是由于該基因序列堿基發(fā)生突變。目前，已報道的有從鼠傷寒沙門桿菌(Salmonellatyphimurium)中獲的抗草甘膦突變株，EPSPS基因的第101位堿基發(fā)生突變，由脯氨酸(Proline)突變成絲氨酸(Serine)，后來在矮牽牛進行EPSPS基因定點突變，也獲得產生抗性的植株[21]。Stalker等在Klebsiellapneumoniae和Escherichiacoli中也發(fā)現相類似的單堿基突變引起的草甘膦抗性突變株，第96位堿基發(fā)生突變，導致甘氨酸(Glyine)突變成丙氨酸(Alaine)，對草甘膦產生比野生型高達800倍的抗性[25-26]。何鳴等發(fā)現第42位堿基發(fā)生突變也會引起植物對草甘膦產生抗性[8]。因此，從突變體庫中篩選和挖掘新的草甘膦抗性基因、對創(chuàng)制和培育抗草甘膦新種質具有重要意義。

本研究以化學誘變劑甲基磺酸乙酯(ethylmethan sulphonate，EMS)處理獲得的貴州地方稻種黎平雜邊禾突變體群體為材料[20]。經除草劑草甘膦噴施處理篩選得到抗性突變株，通過同源克隆、基因測序及序列分析、功能預測，分析該突變水稻植株中EPSPS基因堿基突變引起的結構改變，并預測突變基因編碼產物功能的改變，為挖掘新的草甘膦抗性基因和培育草甘膦抗性水稻新種質提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1　材　料

抗草甘膦水稻材料由貴州大學農業(yè)生物工程研究院利用EMS誘變貴州地方稻種黎平雜邊禾篩選獲得并保存，該水稻突變體命名為osgr-1。RNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自OMEGA公司；TaKaRa反轉錄試劑盒、5 000 bp、2 000 bp ladder DNA marker，LA Taq tm with GC Buffer購自TaKaRa公司；RNase-Free ddH2O購自北京天根生化科技公司，IPTG及X-Gal購自Amersco公司；Trans-5α感受態(tài)細胞購自OMEGA公司，擴增引物合成和回收產物測序由上海英捷生物科技有限公司完成[7,14]。

1.2　突變體EPSPS基因的克隆

1.2.1引物設計

根據NCBI數據庫查詢獲得EPSPS基因cds序列，GenBank：AF 413082.1，利用Primer 5.0在線軟件設計特異性引物，設計擴增引物為：上游30 bp：OsEPSP-F 5-CCCAAGCTTGGGATGGCGTCCAACGCCGCG-3’，下游28 bp：OsEPSP-R 5’-GGAATTCCTCAGTTCCTGACGAAAGTGC-3’[14]。

1.2.2PCR擴增

實驗材料選取黎平雜邊禾與突變體osgr-1嫩葉片，提取葉片中RNA，總PCR反應液25μL：上下游引物各0.5μL,cDNA:1.0μL,TaKaRa LATaq(5 U/μL):0.25μL,GC Buffer Ι∶12.5μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L):4.0μL,RNase-Free ddH2O:6.25μL。PCR反應體系：94 ℃ 3 min(94 ℃ 30 s，60～55 ℃ 30 s)72 ℃ 3.5 min)5 cycles;(94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 3.5 min,30 cycles)72 ℃ 7 min,4 ℃ forever,35 cycles。

1.2.3目的片段TA克隆與鑒定

1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，與p MD 18-T克隆載體在4 ℃條件下過夜連接，連接產物轉化至50μL Trans-5α感受態(tài)細胞，轉化后加900μL LB培養(yǎng)液搖勻復蘇1 h，將復蘇后的菌液涂布于含0.1 mg/mL Amp、0.5%IPTG及0.04 mg/mL X-gal的LB平板培養(yǎng)皿表面，37 ℃避光培養(yǎng)12 h；挑取白色陽性單克隆菌落，用LB(Amp+)培養(yǎng)液37 ℃擴大培養(yǎng)，之后進行菌液PCR鑒定。PCR反應體系為20μL：菌液0.8μL，上下游引物各0.4μL，2×PowerTaqPCR Master Mix 11μL，水7.4μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選陽性菌液送上海英捷生物科技有限公司進行測序[3,9]。

注：Upper line:osgr-1；Lower line:WT cds。　圖3　osgr-1與野生型EPSPS基因序列比對

通過對其編碼的蛋白分析可知蛋白等電點為8.33，在氨基酸第405位疏水性達到高峰，最大值為2.622；在第380～381位親水性達到高峰，值均為-2.656；不穩(wěn)定系數為33.40；脂溶指數為93.95，總平均疏水指數為0.104(圖6)，說明該蛋白為疏水性蛋白。

做法：1.先制起酥面團。先用265 g面粉加涼水、檸檬酸、雞蛋液、鹽和面，揉制15～20 min。將面團放在撒了面粉的面案上餳放 20～30 min。再將人造奶油切成小塊，撒上面粉，攪拌成油面混合物，放案上切成扁平方塊，放冰箱中冷卻至12～14℃。將餳好的面團搟壓成正方形大片，中間稍厚，四邊搟薄些。將冷卻好的人造奶油塊（約130 g），放在方面片中央，從兩側折起包合在一起。然后再把面團重新搟平；疊 4層，再搟平；再疊為 4層，放冷箱內，冷藏 30～40 min；從冰箱取出后，再次搟平，仍疊為4層，入冰箱冷卻。第二次從冰箱取出后，要再次疊為4層，第三次入冰箱冷卻，即成為起酥面團。

1.3　EPSPS基因生物信息學分析

1.3.1主要分析軟件

生物信息學主要分析軟件有：DNAMAN、EditSeq、MegAlign、Potscal、TMPRED、SignalP、Psort、SOPMA及SWISS-MODE等[12,16-17]。

1.3.2EPSPS基因序列分析與結構預測

將克隆的水稻突變體中EPSPS基因序列，用DNAStar序列分析軟件中EditSeq軟件查找其開放閱讀框，DNAMan對所獲得序列進行比對；利用DNAStar中MegAlign序列比對軟件對其相似性進行分析；用Potscal序列分析氨基酸的疏水性；通過在線軟件TMPRED分析其跨膜結構；用SignalP預測蛋白質信號肽；用Psort軟件來對其蛋白進行亞細胞定位；運用SMART對蛋白的結構域進行分析；使用SOPMA在線預測軟件對蛋白質的二級結構進行預測；利用SWISS-MODEL對EPSPS三級結構同源建模，Swiss-PdbViewer對所研究突變體的EPSPS三級結構進行分析[6,16,24]。

2　結果與分析

2.1　總RNA檢測

抗草甘膦水稻突變體osgr-1的基因總RNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測到帶型完整的2條帶(圖1)；測定的A260/A280比值在1.8～2.0之間，表明RNA完整性較好，無蛋白質和DNA污染，測得濃度為1 516 ng/μL，適合進一步反轉錄為cDNA。

2.2　反轉錄為cDNA測序

用TaKaRa反轉錄試劑盒將所有產物反轉錄為cDNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測到帶型完整的條帶(圖2)；將回收的產物送往上海英捷生物科技有限公司進行測序。

圖8為3號試樣在1500 ℃空氣中焙燒86 h后涂層表面XRD物相分析結果．從圖8可見，3號試樣焙燒后的表面涂層主要由碳化硅(Silicon Carbide，PDF42-1091)、莫來石(Mullite，PDF1-613)和二氧化硅(Silicon Oxide，PDF14-260)組成．

2.3　抗草甘膦水稻突變體osgr-1的EPSPS基因堿基突變分析

2.3.1野生型與突變體osgr-1的EPSPS堿基序列比對

通過測序比對(圖3)可知，突變體osgr-1的EPSPS基因cds序列中第226位堿基C變?yōu)镚；第301位堿基G變?yōu)門，第311位堿基A變?yōu)镃。

圖1　突變體osgr-1總RNA瓊脂糖凝膠電泳

圖2　反轉錄EPSPS基因瓊脂糖凝膠電泳

2.3.2蛋白質序列比對

由圖4比對，突變體osgr-1的EPSPS基因編碼的蛋白質中，第76位的脯氨酸變成丙氨酸；第101位的丙氨酸變?yōu)榻z氨酸，第104位的谷氨酸變?yōu)楸彼帷?/p>

2.4　EPSPS基因分析

認定關聯性企業(yè)的最終目的是為了準確定罪和量刑，不枉不縱。為了正確地、合理合法地分割和處理關聯性企業(yè)的相關財產，準確把握政策界限。近年來，立法機關和司法機關不斷通過立法解釋、司法解釋、會議紀要等規(guī)范性法律文件或審判參考對黑社會性質組織的“經濟特征”進行細化，但由于法律規(guī)定無法窮盡社會生活中所有關聯性企業(yè)的財產樣態(tài)，以致在實務中組織性質的認定問題上仍存在模糊且不無矛盾。因此，歸納當前司法實踐的認定標準就具有重要的現實意義，以正確判斷涉案的相關組織是否構成黑社會性質組織、關聯性企業(yè)，進而明確罪與非罪的界限。

注：Upper line: osgr-1的EPSPS基因蛋白質序列；Lower line: WT的EPSPS基因蛋白質序列　圖4　osgr-1與野生型EPSPS基因編碼的蛋白質氨基酸比對

圖5　osgr-1 突變體的EPSPS基因蛋白信號肽分析

圖6　水稻osgr-1 的EPSPS蛋白疏水性分析

采空區(qū)充填后形成含水介質為中粗砂的含水層，圍巖具有隔水作用。地下水的主要補給來源為大氣降水，滲入地下部分沿基巖構造裂隙發(fā)育方向，匯集到中粗砂中，其排泄方式主要為人工開采。經估算，采空區(qū)蓄置的含水層，調節(jié)資源量約為1.3萬m3，單井涌水量大于1000m3/d，成為花崗巖基巖裂隙水貧水區(qū)中的富水地段。

2.4.2蛋白質信號肽分析

利用SignalIP軟件對osgr-1突變體進行蛋白信號肽的預測，分析結果發(fā)現，C-score值為0.158，Y-score值為0.187，S-score值為0.515，SP=‘NO’，D-score值為0.204，各值含量較低，說明該蛋白不存在信號肽(圖5)。

2.4.3蛋白質理化性質分析

2.4.1氨基酸序列分析

2.4.4蛋白質跨膜區(qū)域分析

[4]段明.谷子EPSPS基因的分離、修飾及表達載體的構建[J].江蘇農業(yè)科學,2016,44(5):51-56.

阮亭云： 屢于《盤山志》搜得未收詩文，奉寄可稱快事。 ……《山志》序草成一稿，請正。 愧不能工……甘心受勞受苦，絕不退悔。[3]136

2.4.5蛋白質二級及三級結構預測

利用PSIPRED在線分析osgr-1的EPSPS基因編碼蛋白的分析結果表明，目的蛋白二級結構包含14個α螺旋(α-helix)、25個β折疊(β-strand)，有40個無規(guī)則卷曲(random coil)將α螺旋與β折疊連接(圖9)。利用SWISS-MODEL對WTEPSPS基因編碼蛋白、osgr-1EPSPS基因編碼蛋白三級結構同源建模(圖8)，osgr-1的EPSPS編碼蛋白氨基酸存在不同程度的差異，但三級結構出現明顯差異。三級結構呈單聚體，由2個亞基組成，有4個氯離子、3個鎂離子、1個磷酸根離子的結合位點和2個結構域。結構中可以看到4個折疊區(qū)，其中每個單體有由6個β螺旋組成的折疊區(qū)和4個β折疊區(qū)組成。

圖7　osgr-1 EPSPS基因蛋白跨膜分析

3　討　論

生物信息學已被廣泛應用于病毒研究、基因信息分析、疾病機制的探索等多個生物學領域，已經逐漸成為蛋白質結構與功能預測的重要工具[4]。目前，多參數多方法的綜合性預測提高了其對蛋白質結構和功能預測的準確性[12,27]。EPSPS不僅是一種可促進植物、微生物中的芳香族氨基酸及其它的一些必需的衍生物的生物合成的合成酶，同時也是除草劑草甘膦的作用靶標[5,14]。因此，對EPSPS編碼基因的結構及其功能的生物信息學分析與預測，有利于了解草甘膦與EPSPS蛋白的互作模式，對篩選和培育草甘膦抗性作物新種質提供理論基礎。

培育楊樹大苗的苗期管理工作包括中耕除草、灌水、追肥、防治病蟲害和整形修剪等。移植后適時灌水是提高成活率的關鍵。生長期內結合灌水及時進行中耕和追肥，同時要注意及時發(fā)現和防治苗木病蟲害，對于楊樹大苗，整形修剪是苗期管理的關鍵，特別是截干移植的木。整形修剪的技術有以下幾種：

圖8　osgr-1的EPSPS蛋白三級結構分析

本研究利用生物信息學方法對抗草甘膦水稻突變體osgr-1的EPSPS基因進行分析，發(fā)現突變體osgr-1的EPSPS基因氨基酸序列發(fā)生了3個點突變，從而分別導致其編碼的脯氨酸變成丙氨酸、丙氨酸變成絲氨酸和谷氨酸變?yōu)楸彼幔@與NCBI報道的由脯氨酸變?yōu)榻z氨酸、甘氨酸變?yōu)楸彼嵋约疤K氨酸變?yōu)榧琢虬彼岵煌?，表明EPSPS基因中其它的位點的突變也能引起突變株對草甘膦的抗性。

目前，已從細菌、藻類、植物中分離到EPSPS基因并應用于生產[25]。對農桿菌、大腸桿菌、分枝桿菌、肺炎鏈球菌中EPSPS的晶體結構分析發(fā)現，它們均包括2個相似的結構域，每個結構域由3個亞單位組成，3個亞單位由4個β折疊、2個α螺旋組成[4]，大多數蛋白質在形成成熟蛋白質的過程中需要經過適當的修飾。蛋白磷酸化被認為是自然界中最重要的翻譯后修飾方式，參與信號轉導、基因表達、蛋白質合成、細胞周期等生命活動[6]。經生物信息學分析，抗草甘膦水稻突變體osgr-1的EPSPS基因共編碼511個氨基酸，其編碼蛋白等電點為8.33，在氨基酸第405位疏水性達到高峰，最大值為2.622；在第380～381位親水性達到高峰，值均為-2.656；不穩(wěn)定系數為33.40；脂溶指數為93.95，總平均疏水指數為0.104，說明該蛋白為疏水性蛋白。

圖9　osgr-1 EPSPS基因蛋白二級結構分析

程華等利用RACE技術，克隆到銀杏(GinkgobilobaL.)EPSPS合酶基因(GbEPSPS)的cDNA序列并對其進行生物信息學分析。得出銀杏EPSPS蛋白質序列與其他物種的EPSPS同源性較高。在銀杏的葉和果實中EPSPS基因表達量最高、莖次之、根最低[2]。鞏元勇等在克隆棉花EPSPS基因的過程中，發(fā)現了該基因的一條可變剪接序列。分析發(fā)現，該序列比正常的EPSPS基因的cDNA序列少152 bp，這造成了終止密碼子在該序列的提前出現；EPSPS基因內含子的剪切是按照“AT-AC”規(guī)則，該可變剪接序列預測的三維結構模型同正常的EPSPS基因的三維結構存在顯著差異[5-6]。程海剛等利用點突變技術對所獲EPSPS基因進行定點(E 515 Q)突變，采用RACE技術克隆、拼結出了青麻EPSPS基因的全長cDNA序列，發(fā)現EPSP合成酶有較高的保守性，與歐洲山毛櫸(Fagussylvatica)、水稻(Oryzasativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、菜豆(Phaseolusvulgaris)的EPSPS同源性較高[1,3,19]。Yu等[27]研究發(fā)現，具有草甘膦抗性的牛筋草(Eleusineindica)，抗性來源于其體內EPSPS的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔彼嵬蛔優(yōu)榻z氨酸。EPSPS是草甘膦作用于植物產生抑制的關鍵性合成酶。EPSPS基因存在于細胞核中，但是其成熟的蛋白則存在于葉綠體中[15]。為了提高植物對草甘膦的耐受性，大多數的研究是致力于對EPSPS的分析。

對抗草甘膦水稻突變體osgr-1的EPSPS基因做了詳細的生物信息學功能預測分析，但對突變體osgr-1的抗性機理、突變EPSPS基因功能還需要進一步研究。

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對編碼的蛋白質氨基酸序列進行分析發(fā)現，osgr-1突變體的EPSPS基因共編碼全有511個氨基酸，分子量為53,823 kDa，帶電荷氨基酸118個，占25.97%；酸性氨基酸54個，占11.46%；堿性氨基酸62個，占14.11%；極性氨基酸108個，占20.14%；疏水性氨基酸204個，占34.94%。氨基酸含量較多的是：丙氨酸(Ala，13.50%)，纈氨酸(Val，10.37%)，亮氨酸(Leu，8.81%)，甘氨酸(Gly，8.61%)，絲氨酸(Ser，7.24%)(圖4)。

《意見》明確，要完善居家養(yǎng)老基本服務清單，建立老年人需求評估標準。繼續(xù)擴大“12349”助老公益熱線服務覆蓋面，打造智慧養(yǎng)老服務平臺，采取“三社聯動”方式，為居家生活的老年人提供助餐、助潔、助醫(yī)、助康、助浴、助購、助行等生活服務，以及康復保健、心理疏導、短托照料等專項服務。

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據最新統(tǒng)計顯示，我國耕地面積為20.27億畝，平均每年減少500萬-600萬畝。“如何用越來越少的土地、越來越少的水資源、越來越少并越來越貴的勞動力生產出更多、更好、更安全的農產品，是我國農業(yè)接下來面臨的挑戰(zhàn)?！笨卤赋觯磥碇袊r業(yè)的發(fā)展必須突破肥料制造技術、土壤技術與保護技術的瓶頸，土壤修護與有機質提升需要政府強力推動，更需要龍頭企業(yè)積極參與。瑞豐生態(tài)在基層土壤修護方面走在同行前列，并做了大量有益工作，取得了明顯成效，需要認真總結經驗，進一步加大對推廣模式與基層土壤修護服務體系、工作站的宣傳推廣，不斷擴大推廣區(qū)域，在全國起引領作用。

漢語對外來詞的吸收改造功能則遠不如日語，其對外來語的態(tài)度是一個至關重要的因素。與日本對外來文化的“拿來主義”不同，漢民族對外來文化本來就抱有一種警惕和排斥的心理。因此在外來詞的吸收過程中，也總是力圖與其劃清界限，盡可能避免直接使用外來詞或對其進行任何形式的改造，而是更多地采取意譯。

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鼻科醫(yī)師應該認真對待每一次醫(yī)學模型中的解剖訓練。在模擬標本操作前，鼻科醫(yī)師應當首先熟練掌握鼻腔鼻竇、鼻顱底、鼻眶相關解剖的理論知識，并仔細閱讀鼻鼻竇CT，了解鼻腔鼻竇解剖異常情況，需要充分熟悉鼻內鏡鼻竇手術相關的器械特點和性能。具體操作過程中，必須注意規(guī)范化鼻內鏡技術操作，明確掌握技術要點。我們推薦的鼻內鏡鼻竇手術規(guī)范化操作步驟如下。

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2）安裝隊伍進場拆除原2臺射水泵→NASH水環(huán)式真空泵運輸就位并固定基礎→真空泵進汽/排空氣管道→冷卻水進水/排水管道的測量預制焊接→管道防腐→電氣接線→儀表更改真空泵DCS啟、停畫面及邏輯程序→一次性調試成功，耗時32h，參與技術工數量7人。

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我們的先祖憑借超然的修養(yǎng)與執(zhí)著的信念，留下了無數精美的木雕作品給我們，形成豐富的樣式、風格和活力，為我們的精神世界增添了繽紛的情思。早在秦漢時期，中國木雕就凸顯出熟練的技藝水平與細膩的創(chuàng)意，那些深藏于各種漢墓中的文物，無論人物還是動物，無一不顯現出先人對生命氣息、美學理念的孜孜不倦的探尋。每個單一的個體，放在群組之中，其“性情”依然鮮活，而從整體的角度看，它們又能恰當地表述特定歷史時期的訊息。

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