鄒　紅　李　燦　汪潤秋　李文祥　吳山功　王桂堂　李　明

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 農(nóng)業(yè)部淡水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072; 2.武漢輕工大學(xué)動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院, 武漢 430023)

蛙片蟲是一類多核、無口, 滲透性營養(yǎng)的鞭毛類原生動物。絕大多數(shù)寄生在變溫脊椎動物體內(nèi),特別是無尾兩棲動物(蛙類和蟾蜍的成體及蝌蚪)的腸道內(nèi)[1]。由于其皮層構(gòu)造與纖毛蟲頗為相似, 該類群長期以來一直被歸為較原始的纖毛蟲類(Protociliate)[2—4]。后來發(fā)現(xiàn)這類原生動物沒有大小核的分化, 無性生殖為縱二分裂, 有性生殖能產(chǎn)生具鞭毛的配子, 故將其納入鞭毛蟲類, 并單列為蛙片亞門(Opalinata)[5,6]; 下分1綱、1目、1科, 即： 蛙片綱(Opalinatea), 蛙片目(Opalinida), 蛙片科(Opalinidae)[7]。根據(jù)蛙片蟲形狀和細(xì)胞核數(shù)目的不同, 可分為兩個亞科, 即原蛙片蟲亞科(Protoopalininae)和蛙片蟲亞科(Opalininae)。

原蛙片蟲屬(Protoopalina)隸屬于原蛙片蟲亞科, 是兩棲動物腸道中最常見的蛙片蟲類。該屬由Metcalf在1918年建立, 其典型特征是蟲體常呈長棍狀, 具2個或4個圓形或紡錘形胞核[3]。澤蛙原蛙片蟲(P. limnocharis)是Nie(1932)首次從澤蛙腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)并命名的[8]。囿于當(dāng)時染色技術(shù)和觀測工具的落后, 一些關(guān)鍵的形態(tài)特征如縫線等未能很好地予以揭示。因而, 利用現(xiàn)代技術(shù)手段對其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行重新描述和修正顯得尤為必要。

1　材料與方法

1.1　宿主蛙來源

澤蛙(Fejervarya limnocharis)成體210只于2016年6月采自湖北省洪湖市(北緯29°40′—29°58′N;東經(jīng)113°12′—113°26′E), 活體運回并暫養(yǎng)于實驗室。

1.2　光鏡觀察

活體觀察將宿主蛙用100%酒精麻醉后解剖、取腸道, 置于體視顯微鏡Zeiss Stemi SV6/Axio Cam MRc5下觀察腸道內(nèi)含物。用0.65%生理鹽水浸漬內(nèi)含物后收集部分蟲體置凹玻片上, 置于光學(xué)顯微鏡下觀察其活體形態(tài)。

固定染色標(biāo)本觀察將部分蟲體置胚胎皿中, 飽和升汞(HgCl2)溶液固定, 分別用埃利希蘇木精(Ehrlich’s haematoxylin)和蛋白銀(Protargo)染色,加拿大樹膠封片, 用于觀察蟲體皮層及內(nèi)部構(gòu)造。全部觀察、測量、拍照均使用德國蔡司顯微成像系統(tǒng)Zeiss Axioplan 2 imaging and Axiophot 2完成。

1.3　掃描電鏡觀察

將游離出的大量蟲體4000×g離心10min, 2.5%(v/v)戊二醛水溶液與2% (w/v)鋨酸水溶液的1∶1混合液于4℃固定2h。用0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)清洗后置于涂有1%多聚賴氨酸1 cm×1 cm的玻片上。常規(guī)脫水、乙酸異戊酯置換處理后, 臨界點干燥2h (HCP-2 Crtical Point Dryer)。離子濺射儀(EikoIB-3 Ion Coater)鍍膜噴金后, 掃描電鏡Quanta 200 (FEI, Holand)觀察。

2　結(jié)果

在我們采集的210只澤蛙中, 有38只感染了澤蛙原蛙片蟲。感染率為18.1%, 寄生于澤蛙直腸。固定染色標(biāo)本保存于中國科學(xué)院水生生物研究所寄生蟲學(xué)與協(xié)同進(jìn)化學(xué)科組。

圖 1　澤蛙原蛙片蟲的光鏡顯微照片F(xiàn)ig. 1　Light microscope images of P. limnocharis

澤蛙原蛙片蟲蟲體呈長棒狀, 略扁平(圖 1A,B和2A)。前端凸出、稍狹窄, 約占蟲體1/10 (圖2A, C); 其后為蟲體最寬處, 至尾端漸趨細(xì)削(圖2A, D)。體長為313.8 μm (283.2—350.4 μm, n=30),體寬27.1 μm (21.6—38.4 μm, n=30)。長寬比約為10∶1。蟲體周身密被鞭毛, 游動迅速且常翻轉(zhuǎn)前行(圖 2C)。體表皮褶形成的條紋與蟲體縱軸傾斜?？p線位于蟲體頂端, 長約20 μm。所有體動基列(約30—40列)均從縫線兩側(cè)發(fā)出, 沿蟲體前端一直延伸至尾部(圖 1C, D)。

胞核2個, 梨形; 其一在蟲體前端約1/6處, 另一個在位于蟲體中部略前處(圖 1B)。核長19.3 μm(14.4—24.0 μm, n=30)), 寬5.5 μm (4.2—8.4 μm,n=30)。胞核分裂時從中部縊縮(圖 1E), 逐漸向兩端拉長并形成一條細(xì)絲(圖 1F)。此細(xì)絲在蟲體整個生活周期都一直存在, 成熟蟲體中其長度為112.92 μm (76.8—127.2 μm, n=30)(圖 1G)。另外,在胞質(zhì)中可見大量大小不一、圓球狀的顆粒(圖1E, F和G)。

蟲體相關(guān)形態(tài)學(xué)特征測量值見表 1,模式圖見圖 3 。

3　討論

表 1　澤蛙原蛙片蟲形態(tài)學(xué)特征測量值(單位： 微米)Tab. 1　Biometrical values (in μm) on Protoopalina limnocharis inhabiting Fejervarya limnocharis (=Rana limnocharis)

圖 3　澤蛙原蛙片蟲的模式圖Fig. 3　Schematic drawing of P. limnocharis

澤蛙原蛙片蟲是由Nie (1932)首次從澤蛙腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)并命名的[8]。該蛙片蟲目前僅在澤蛙中發(fā)現(xiàn), 應(yīng)該具有較為嚴(yán)格的宿主專一性。本研究中測量蟲體樣本所得形態(tài)特征參數(shù)值與Nie所記述值頗為相符(包括體長、體寬, 核長、核寬; 表 1)。然而,有2個重要的分類特征需要進(jìn)行補(bǔ)充和修正： (1)縫線位于蟲體頂端, 貫穿背腹側(cè); 所有體動基列均從縫線兩側(cè)發(fā)出, 這在前人的研究中沒有描述。該結(jié)構(gòu)特征與我們已經(jīng)研究過的寄生于沼蛙和黑斑蛙腸道內(nèi)的原蛙片蟲Protoopalina pingi的縫線結(jié)構(gòu)是一致的[9], 而且它們的體動基列均與蟲體縱軸平行延伸, 所不同的只是兩者體動基列的數(shù)目不同： P.limnocharis有30—40列, P. pingi有18—29列[9]。(2)胞核分裂時在兩新核間產(chǎn)生的連接細(xì)絲, 在蟲體整個生活周期一直存在。這一結(jié)構(gòu)在其他已知的原蛙片蟲屬種類中未見報道, 其有何生物學(xué)功能亦不清楚。此外, 我們在觀察分裂完成不久產(chǎn)生的P.limnocharis新生蟲體時, 發(fā)現(xiàn)它們體內(nèi)的2個胞核距離均較近且有細(xì)絲牽連; 但不同新個體中胞核的位置是有區(qū)別的： 其中一部分蟲體內(nèi)2個胞核均位于身體前端, 另一部分則處于蟲體中部位置, 這2種位置分別對應(yīng)成熟蟲體中2個胞核的位置。據(jù)此推測P. limnocharis子代蟲體中的2個胞核均來自于母體中同一個核, 而其兩核間的連接細(xì)絲可能是胞核分裂進(jìn)化歷程中比較原始的殘跡。

就胞核數(shù)量而言, 已知原蛙片蟲的種類絕大多數(shù)為2個核, 如P. limnocharis、P. caudata michyla[10]、P. heleophrynes[11]、P. pomacantha[12]等。也有個別種類核數(shù)不定, 如P. pingi多為四核, 有時兩核或六核[9]; P. quadrinucleata核數(shù)最多時可達(dá)8個[13]。作者認(rèn)為這種核數(shù)不定的現(xiàn)象應(yīng)該是在蟲體分裂過程中胞質(zhì)分裂和核分裂不同步造成的; 核數(shù)不定的種類應(yīng)該是原蛙片蟲屬中進(jìn)化程度較低的種類, 而核數(shù)穩(wěn)定為兩核的種類進(jìn)化程度較高。

另外, 關(guān)于蛙片蟲類的分類依據(jù), 長期以來一直爭議頗多; 但主流上基本沿用Metcalf的界定方法[4]： 雙核、圓柱狀種類歸為Protoopalina, 雙核、扁平狀種類歸為Zelleriella, 多核、圓柱狀種類歸為Cepedea, 多核、扁平狀種類歸為Opalina。根據(jù)我們目前已有的形態(tài)學(xué)工作基礎(chǔ)(特別是銀染標(biāo)本)和分子生物學(xué)數(shù)據(jù)(全rDNA序列), 我們認(rèn)為這種分類方法是基本正確的。這將在我們的研究中進(jìn)一步補(bǔ)充、求證并最終得到較為合理的結(jié)論。

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